菌種製作菌液的方法（以一瓶為例）1、取10公斤無菌水裡面的2公斤燒開，然後加入1公斤的紅糖，把紅糖充分融化開，便於把紅糖裡面的有害菌消除。 2、把3公斤的紅糖水和剩下的8公斤無菌水裝到一個15公斤的容器裡，混合均勻，等無菌水冷卻到30-40度的時候加菌種1瓶。 3、把菌種和紅糖水充分的攪拌均勻，口上蓋一層塑膠薄膜，要密封發酵，不能漏氣。不要裝的太滿，要預留10-15%的緩衝空間，在發酵過程中會產生氣體，裝滿容易漲破塑膠容器。 4、發酵7-12天天左右，溫度低要多發酵幾天，開啟瓶口，有氣體產生。聞到酸香味夾雜酒糟味和紅糖水的刺激性氣味，到就證明發酵成功。（低於15度不能發酵；15-20度發酵20-15天；20-30度，發酵15-10天；30-40度發酵10-6天，發酵時間越長效果越好）；或者用PH試紙測試，PH值顯示4-5之間即表明發酵成功。如果溫度過低，強烈建議用取暖燈或者火爐等加熱裝置升溫。 5、發酵成功後的菌液如果一次不能大量的使用完，就用小瓶子分裝密封儲存。使用一瓶開啟一瓶。如果沒有分裝。 儲存方法：1、菌液宜在常溫下避光儲存，底部稍有沉澱或浮有些微白沫均屬正常，若氣味不酸（PH應在4.5以下）或腐臭即已變質勿用。 2、每次用後蓋緊瓶蓋。保管得好，一年後無異味仍可使用，只是活性有所降低，需適當加大用量。 注意事項：1、製作菌液最好用深井水，若用自來水應放置24小時後用，水只需燒開1/5能夠融化開紅糖即可。 2、菌液不要與殺菌劑等藥物同時混用，要用此類藥物，相隔一天以上時間。 3、紅糖用熱水溶化後，水溫降到30-40度，才能投入農盛樂菌種。過高或者過低均影響發酵效果。 4、製作菌液的過程中，不要頻繁開啟蓋子，以免進入雜菌，影響發酵效果。 5、如若遇到特殊問題，請撥打銷售電話詳詢，不要擅做主張，以免對你造成損失。

在自然界裡，食用菌都不是單獨存在的，而是和許多細菌、放射菌、黴菌等生活在一起的。所謂菌種分離，就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來，透過培養，獲得純的優良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。

(一）母種的分離培養

食用菌母種的分離，可分為孢子分離法、組織分離法以及基內菌絲分離等。

1.孢子分離法

孢子分離法，是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發成菌絲，培養成菌種的方法。這種菌種生活力較強，但孢子個體之間有差異，且自然分化現象較嚴重，變異大，需經出菇試驗才能在生產上應用。

（l）單孢分離法：是每次或每支試管只取一個擔孢子， 讓它萌發成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲，有結實能力，可採用此法分離生產純菌種。單孢分離生產上較少採用，而且技術複雜，一般採用多孢分離法。

（2）多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養基上，讓它們萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法，有以下幾種：

①種菇孢子彈射法：選擇個體健壯、朵形圓正，無病蟲害、出菇均勻、高產穩產，適應性強的八九分成熟的種菇，切去大部分，菌柄用無菌水沖洗數遍後再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸乾表面水分。在接種箱或無菌室內，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養皿上面；上端小孔用棉花塞住。培養皿放在一個鋪有紗布的搪瓷盤上，靜置12～20小時，菌褶上的孢子就會散落在培養皿內。形成一層粉末狀孢子印（平菇極淡紫色，蘑菇、草菇 為褐色，香菇、金針菇孢子印白色）。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養皿上劃線接種。待孢子萌發，生成菌落時，選孢子萌發早、長勢好的菌落進行試管培養。

還可用孢子採集器收集孢子。方法是選好種菇後，按上述程式，輕輕掀開玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子採收器的鋼絲架上，放在培養皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鍾掌周圍塞好。並在紗布上倒少許昇汞或無菌水。移入 20℃左右恆溫箱培養。

②褶上塗抹法：按無菌操作分離時；應選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子，再在培養基上劃線接種。

④貼附法：按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊， 用溶化的瓊脂培養基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養基正上方的試管壁上。經6～12小時的培養，待孢子落在斜面上，立即把孢子連同部分瓊脂培養基移植到新的試管中培養即可。

孢子分離得到的母種、必須進一步提純復壯，當母種定植一星期左右，菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管，進而轉管擴大，一般到栽培種，轉管不宜超過5次。

孢子分離得到的母種，必須通過出菇試驗，鑑定為優質菌種後，才可供生產使用。

一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分離法獲得母種。

現就銀耳孢子分離略述於下：

按無菌操作獲取種耳後，懸掛種耳的三角瓶經12小時培養後，瓶底培養基表面就有"孢子印"。取出種耳，置 20℃—25℃溫箱培養2～3天，培養基表面會出現乳白色透明的糊狀小菌落，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時移接入試管斜面培養基上，待長滿斜面後，再移接入營養豐富，且表面比較乾燥的培養基上。經30天左右，菌落長出白色菌絲。

銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌（香灰菌絲）混合培養時，由後者幫助分解木材及其他一些纖維物質，提供營養，才能利於銀耳孢子萌發，菌絲的定植和子實體的形成。

在兩種菌絲交會時，先選出兩種純菌絲。

羽毛狀菌絲要純化選育，一般要選取生長迅速，爬壁力強的試管斜面或種瓶，取先端菌絲，轉管移接，置25℃—28℃上培養，重複轉管幾次即可得到優良純種。

銀耳菌絲的特點，菌絲生長緩慢，擔孢子也不易萌發。在進行兩菌混合時，先取經8～IO天培養的銀耳菌絲斜面，按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5釐米處接入一 小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養1周即得到混合好的銀耳母種。

2．組織分離培養法

利用子實體內部組織，進行無性繁殖而獲得母種的簡便方法，即組織分離。該法操作簡便，菌絲生長髮育快，品種特性易儲存下來，特別是雜交育種後，優良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩定下來。常採用以下分離方法。

（l）子實體分離：種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優良品種。切去菇兩基部，在無菌箱內以0.1％的昇汞水浸幾分鐘，再用無菌水沖洗並揩乾或用75％酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進行表面消毒。接種時，只要將種菇撕開，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織；移接 到PDA培養基上。置25℃左右溫度下培養3-5天，就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲，轉管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。

（2）菌核分離：茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易採集。而常見的是它貯藏營養的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗淨，用酒精或昇汞消毒後，切開菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA 培養基斜面上，保溫培養。應注意的是，菌核是貯藏器官，大部分是多糖類物質，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，如果組織塊過小，則不易分出菌種。

（3）菌素分離：有一部分子實體不易找到，也沒有菌核，可以用菌素進行分離。如蜜環菌、假蜜環菌。其操作方法是先用酒精或昇汞將菌素表面黑色皮層輕輕擦拭2～3次， 然後去掉黑色外皮層（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用無菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養基上，保溫培養，即得該菌菌種。

菌素分離要注意：因菌素比較細小，分離素也比較細小，分離時極易汙染雜菌，所以要嚴格操作。

3．基內菌絲分離培養法

利用食用菌生育的基質作為分離材料，來得到純菌種的一種方法，叫基內菌絲分離法。

此種分離方法是適宜只有在特定的季節才出現，而且是朝生暮死，不易採得的子實體。基內分離法與組織分離法不同之點是，乾燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀態。接種後有時並不立刻恢復生長。因此，有必要保留較長的時間（約1個月），以斷定菌絲是否能成活。基內菌絲分離法又可分為，材中菌絲分離（即菇木或耳木分離法）及土中菌絲分離法等。

（1）材中菌絲分離法：就是菇木或耳木分離法，為了減少雜菌的感染，菇（耳）木在分離之前，必須進行無菌處理。可以把菇（耳）水錶面用酒精燈火焰輕輕燒過，以燒死黴菌的孢子，或再用0.1％的昇汞水浸孢幾分鐘，然後用無菌水沖洗後用無菌濾紙吸乾。接種塊切取時應注意。接種塊必須在該菌菌絲分佈的範圍內切取。所以，菌絲生長緩慢的種類應淺取；菌種生長快的種類可以深取。同時。還應根據菇菌的種類、木材質地、菇（耳）木粗細、發育時間的長短來確定菌絲分佈的範圍。然後用一把利刀進行切取。接種塊應儘量小些，以減少雜菌感染機會，提離菌種的純度。接種塊移到培養基上，就應該放到適合菌絲生長的22℃～26℃ 的溫室或溫箱中培養，使菌絲恢復生長。

（2）土中菌絲分離：食用菌種類很多，許多土生的食用菌；孢子不易萌發。組織分離也不易成功，用土中菌絲分離獲得純種的方法，叫土中菌絲分離。

土中菌絲分離時要注意，由於土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物，因此分離時必須儘可能避開這些微生物的干擾，儘可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接種，反覆用無菌水沖洗，在培養基中加入一些抑制細菌 生長的藥物，如 40微克／升的鏈黴素或金黴素。如發現感染細菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來，接種到木屑培養基中。因細菌沒有分解木質素的能力，因此在木屑培養基中不易擴充套件；只侷限於接種處。待菌絲長出感染區後，就可以再進行擴大提純了。

（3）子實體基部分離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體基部分離出新菌絲的方法，叫子實體基部分離，現以袋栽銀耳為例說明：

從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中；選擇生活力最強的幼耳5袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場所進行後期培養，以增強菌絲體的生活力。經培養7～10天后，待子實體直徑達4～5釐米時便可取回，作為分離的母體。再從中篩選最理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實體，放置於 0℃的冰箱或有敵敵畏的容器中過夜，以便殺死瓶中的害蟲。然後用75％酒精或昇汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質，連同接種工具、接種培養基等移進無菌室。經滅菌後，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，並進行培養。待袋口露出白色菌絲時，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結體，迅速移入母種試管培養基的中央，輕輕地脫去接種針， 塞上棉塞。 為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管，以便從中選擇。分離後應及時移入22℃—24℃恆溫箱或溫室中培養。由於培養基內水分較多，菌絲恢復要比耳木分離得快。經2-3天后，分離物的邊緣就可看 到白色菌絲。每天要至少觀察兩次，以便提純。觀察、提純方法與耳木分離法擔同。經適溫培養10-15天后，當接種塊扭結團出現紅、黃色水珠時，即可擴大原種。

（二）原種和栽培種的接種培養

母種獲得以後，為了滿足菌種生產的需要。應選出優良、純度高的母種進一步擴大為原種。

原種培養基一般採用棉籽殼、木屑、草類等培養基。

瓶裝或袋裝的原種培養基滅菌後，可送入滅過菌的接種箱內，待瓶中的培養基冷至30℃以下，可按照無菌操作程式進行接種。

菌種瓶（袋）放入培養室時，要經常進行檢查，一經發現雜菌汙染，立即取出。培養成的原種，菌絲體必須健壯有力，緊貼瓶壁而不幹縮，顏色純正，具有一定清香味，生活力強，擴製成栽培種時吃料快。

栽培種就是將原種進一步擴大培養成三級種，它和原種的接種及培養相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木、棉皮作培養基。蘑菇多用糞草做培養料。

栽培種要求料塊不脫水乾縮。菌絲體健壯有力、顏色純正，有清香味，無老化現象，無雜菌汙染，有的種許可有少量原基，接入栽培料後，發菌快，長勢好，生活力強。

原種在接栽培種時，原種瓶口的一層菌絲體應挖去不用。

（三）液體種的簡單培養

目前，用液體深層發酵法生產菌種，具有生產量大、週期短、菌齡整齊、成本低廉、接種方便等特點，是實現食用菌工廠化生產的目標。現將液體種培育過程簡述於後，供參考。

簡言之就是將純正優良的菌種，接入液體培養基（固體培養基不加凝固劑），使菌絲繁殖形成大量小菌球，然後將這種培養基拌入木屑或棉籽皮料內，製成菌塊、培養其形成子實體。還可用於制原種、栽培種。

培養液體菌種，可將培養液裝入三角瓶中，約佔空瓶的五分之一重量。用搖瓶機（也稱搖床）來培養。搖瓶機有旋轉式和往復式兩種，一般多用往復式。液體培養基可用馬鈴薯汁（加糖），麥芽汁配製，也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機鹽等配製。可以混合培養基，因適用於多種食用菌和藥用菌的培養，均有好效果。組分：豆餅粉2％，玉米粉1％， 葡萄糖3％，酵母粉0.5％，磷酸二氫鉀0.1％，碳酸鈣 0.2％， pH自然， 12℃滅菌半小時。然後接種培養。

如果生產量較大，在三角瓶的基礎上，再逐級擴大種子缸，發酵罐中進行液體深層通氣發酵，產生大量菌種。但由於生產中要求裝置繁多，技術性強，我們還應創造條件；實現食用菌栽培的現代化。

（四）菌種質量的鑑定

菌種質量鑑定最好的方法是，做出菇試驗。但是時間比較長。在購置菌種時，或在菌種生產中，如何能知菌絲生長情況，快速判斷菌種質量？我們介紹幾種方法：

1.肉眼觀察：優良菌種菌絲濃白，絨狀，粗壯密集，生長整齊，速度快，香味濃厚。

2.優良菌種標準可歸納為："純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時，開啟瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體，觀察色澤，聞其氣味，手捏料塊檢查其含水量，看是否符合上述要求標準。

3.顯微鏡檢查：挑取少量菌絲，置顯微鏡上觀察其形態，菌絲分枝，分隔情況，鎖狀聯合，細胞膜的厚薄。 培養觀察：從菌種瓶中挑取小塊菌絲體，接種斜面試管培養基上，置23℃～25℃恆溫中培養，經五週後檢查菌種生活力。如果菌絲生長快，旺盛純一，健壯濃厚，長且整齊，則表示菌種的生活力強。

4.分塊法：在桌上放一張白紙，把菌齡相同的菌種從瓶內取出一大塊，用手分成2塊，再把2塊分成4塊，4塊 分成8塊，依次進行。優良菌種整塊多，碎渣少。劣次菌整塊少，碎渣多。

5.液體菌種鑑別：當三角瓶或發酵缸培養3-7天后，如液麵出現氣泡，產生"油皮"、混濁等現象，說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮，或遲遲長出很薄的菌絲層，則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀，表明菌種生命力強。

（五）菌種生產過程中的雜茵防治

在生產菌種時，要時刻注意雜菌汙染，以防為主，一旦發生，根治很不容易。所以整個制種過程都必須在無菌條件下進行。接種箱及所有分離、接種的用具、器皿，都要進行嚴格的消毒滅菌。工作人員的雙手要用消毒劑清洗，並穿戴消過毒的工作服、帽和口罩，動作要敏捷、準確，儘量不要講話走動，以防空氣中的雜菌感染。

分離母種時，選擇出菇早、生活力強，第一潮菇是關鍵，因它生活力強，接種後迅速佔領陣地，無雜菌侵入的機會。

被汙染的菌種，原因是多方面的，一般是滅菌不徹底所致，或因接種時無菌操作不嚴、瓶蓋不合適造成的。所以滅菌一定要徹底，最好在接種萌將培養基置25℃左右溫箱中做效果檢查，經2天不長雜菌，說明徹底，可以使用，接種過程中一定要嚴格無菌操作。

汙染雜菌另一個原因可能是分離母種時感染雜菌，因種菇表面帶菌，消毒不徹底，透過組織塊將雜菌帶入培養基。

總之，汙染機會很多，要注意環境消毒，按無菌操作規程徹底滅菌，層層把關，環環抓緊，嚴加註意；提離菌種質量。

菌種是指食用菌菌絲體及其生長基質組成的繁殖材料。菌種分為母種（一級種）、原種（二級種）和栽培種（三級種）三級。工業發酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復篩。

挑選具有某種能力的有用菌種，也稱種子製備，是指菌種在一定條件下，經過擴大培養成為具有一定數量和質量的純生產菌種的製備過程。以作接入發酵罐中進一步擴大菌體量及合成產物之用。

種子製備包括孢子製備和菌絲體製備（見圖） 菌種製備 ，其中(1)～(4)為孢子製備過程。

儲存在沙土管或冷凍管中的生產菌種，用無菌手續挑取少許，接入瓊脂斜面培養基上，在25℃（或較高溫度）下培養5～7天（或較長時間。所得孢子還需進一步用較大表面積的固體培養基以獲得更多孢子（對於黴菌類孢子製備，多數採用大米、小米之類的天然培養基）。

將培養成熟的斜面孢子製成懸浮液，接種到扁瓶固體培養基上，於25～28℃培養14天。將成熟的扁瓶孢子於真空中抽乾，使水分降至10%以下，並放入 4℃冰箱中備用。一次製得的孢子瓶可在生產上延續使用半年左右。

放線菌孢子的培養基大多是採用麩皮或豌豆浸出液、牛肉膏及無機鹽與瓊脂製成的。將斜面孢子接入擴大的扁瓶孢子培養基中,於28～37℃培養5～14天。所獲得的大量孢子可直接作為種子罐(6)的種子。

如果有些生產菌種不產孢子，如赤黴素產生菌或產孢子不多的，則可採用搖瓶(5)液體培養製得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發芽、生長、繁殖成大量菌體。其中的培養基組分應是易於被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿），及無機鹽(如磷酸鹽)等。作為發酵罐(7)的種子應生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯，無雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。

目標

1. 弄清一級菌種的製作流程。

2. 弄清一級菌種的培養基的配製方法及其要求。

3. 弄清滅菌，消毒，菌種分離，提純，轉管，無菌操作概念及其操作方法。

4. 掌握一級菌種質量鑑定及其常見儲存方法。

重點難點

1. 一級菌種培養基的配製。

2. 一級菌種培養基的滅菌。

3. 無菌操作（難點）。

培育食用菌菌種需要一定的技術水平和裝置。

簡略的說，首先製備母種培養基，裝試管，滅菌，接種，培養；然後製備原種培養基，裝瓶，滅菌，接種，培養；最後再製備栽培種培養基，裝袋，滅菌，接種，培養。培養完成就可以用了。

當然，食用菌種類很多，您可以根據自己需要從網上搜索一下相關資料下載即可。

香菇菌種怎樣培養出來的?

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植物網植物相關一站搞定！2018-10-24

自然界裡，食用菌都不是單獨存在的，而是和許多細菌、放射菌、黴菌等生活在一起的。所謂菌種分離，就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來，透過培養，獲得純的優良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。

(一)母種的分離培養

食用菌母種的分離，可分為孢子分離法、組織分離法以及基內菌絲分離等。

1.孢子分離法

孢子分離法，是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發成菌絲，培養成菌種的方法。這種菌種生活力較強，但孢子個體之間有差異，且自然分化現象較嚴重，變異大，需經出菇試驗才能在生產上應用。

(l)單孢分離法：是每次或每支試管只取一個擔孢子，

讓它萌發成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲，有結實能力，可採用此法分離生產純菌種。單孢分離生產上較少採用，而且技術複雜，一般採用多孢分離法。

(2)多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養基上，讓它們萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法，有以下幾種：

①種菇孢子彈射法：選擇個體健壯、朵形圓正，無病蟲害、出菇均勻、高產穩產，適應性強的八九分成熟的種菇，切去大部分，菌柄用無菌水沖洗數遍後再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸乾表面水分。在接種箱或無菌室內，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養皿上面;上端小孔用棉花塞住。培養皿放在一個鋪有紗布的搪瓷盤上，靜置12～20小時，菌褶上的孢子就會散落在培養皿內。形成一層粉末狀孢子印(平菇極淡紫色，蘑菇、草菇

為褐色，香菇、金針菇孢子印白色)。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養皿上劃線接種。待孢子萌發，生成菌落時，選孢子萌發早、長勢好的菌落進行試管培養。

還可用孢子採集器收集孢子。方法是選好種菇後，按上述程式，輕輕掀開玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子採收器的鋼絲架上，放在培養皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鍾掌周圍塞好。並在紗布上倒少許昇汞或無菌水。移入

20℃左右恆溫箱培養。

②褶上塗抹法：按無菌操作分離時;應選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子，再在培養基上劃線接種。

④貼附法：按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊，

用溶化的瓊脂培養基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養基正上方的試管壁上。經6～12小時的培養，待孢子落在斜面上，立即把孢子連同部分瓊脂培養基移植到新的試管中培養即可。

孢子分離得到的母種、必須進一步提純復壯，當母種定植一星期左右，菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管，進而轉管擴大，一般到栽培種，轉管不宜超過5次。

孢子分離得到的母種，必須通過出菇試驗，鑑定為優質菌種後，才可供生產使用。

一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分離法獲得母種。

現就銀耳孢子分離略述於下：

按無菌操作獲取種耳後，懸掛種耳的三角瓶經12小時培養後，瓶底培養基表面就有"孢子印"。取出種耳，置

20℃—25℃溫箱培養2～3天，培養基表面會出現乳白色透明的糊狀小菌落，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時移接入試管斜面培養基上，待長滿斜面後，再移接入營養豐富，且表面比較乾燥的培養基上。經30天左右，菌落長出白色菌絲。

銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌(香灰菌絲)混合培養時，由後者幫助分解木材及其他一些纖維物質，提供營養，才能利於銀耳孢子萌發，菌絲的定植和子實體的形成。

在兩種菌絲交會時，先選出兩種純菌絲。

羽毛狀菌絲要純化選育，一般要選取生長迅速，爬壁力強的試管斜面或種瓶，取先端菌絲，轉管移接，置25℃—28℃上培養，重複轉管幾次即可得到優良純種。

銀耳菌絲的特點，菌絲生長緩慢，擔孢子也不易萌發。在進行兩菌混合時，先取經8～IO天培養的銀耳菌絲斜面，按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5釐米處接入一

小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養1周即得到混合好的銀耳母種。

2.組織分離培養法

利用子實體內部組織，進行無性繁殖而獲得母種的簡便方法，即組織分離。該法操作簡便，菌絲生長髮育快，品種特性易儲存下來，特別是雜交育種後，優良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩定下來。常採用以下分離方法。

(l)子實體分離：種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優良品種。切去菇兩基部，在無菌箱內以0.1%的昇汞水浸幾分鐘，再用無菌水沖洗並揩乾或用75%酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進行表面消毒。接種時，只要將種菇撕開，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織;移接

到PDA培養基上。置25℃左右溫度下培養3-5天，就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲，轉管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。

(2)菌核分離：茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易採集。而常見的是它貯藏營養的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗淨，用酒精或昇汞消毒後，切開菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA

培養基斜面上，保溫培養。應注意的是，菌核是貯藏器官，大部分是多糖類物質，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，如果組織塊過小，則不易分出菌種。

(3)菌素分離：有一部分子實體不易找到，也沒有菌核，可以用菌素進行分離。如蜜環菌、假蜜環菌。其操作方法是先用酒精或昇汞將菌素表面黑色皮層輕輕擦拭2～3次，

然後去掉黑色外皮層(菌鞘)，抽出白色菌髓部分;用無菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養基上，保溫培養，即得該菌菌種。

菌素分離要注意：因菌素比較細小，分離素也比較細小，分離時極易汙染雜菌，所以要嚴格操作。

3.基內菌絲分離培養法

利用食用菌生育的基質作為分離材料，來得到純菌種的一種方法，叫基內菌絲分離法。

此種分離方法是適宜只有在特定的季節才出現，而且是朝生暮死，不易採得的子實體。基內分離法與組織分離法不同之點是，乾燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀態。接種後有時並不立刻恢復生長。因此，有必要保留較長的時間(約1個月)，以斷定菌絲是否能成活。基內菌絲分離法又可分為，材中菌絲分離(即菇木或耳木分離法)及土中菌絲分離法等。

(1)材中菌絲分離法：就是菇木或耳木分離法，為了減少雜菌的感染，菇(耳)木在分離之前，必須進行無菌處理。可以把菇(耳)水錶面用酒精燈火焰輕輕燒過，以燒死黴菌的孢子，或再用0.1%的昇汞水浸孢幾分鐘，然後用無菌水沖洗後用無菌濾紙吸乾。接種塊切取時應注意。接種塊必須在該菌菌絲分佈的範圍內切取。所以，菌絲生長緩慢的種類應淺取;菌種生長快的種類可以深取。同時。還應根據菇菌的種類、木材質地、菇(耳)木粗細、發育時間的長短來確定菌絲分佈的範圍。然後用一把利刀進行切取。接種塊應儘量小些，以減少雜菌感染機會，提離菌種的純度。接種塊移到培養基上，就應該放到適合菌絲生長的22℃～26℃

的溫室或溫箱中培養，使菌絲恢復生長。

(2)土中菌絲分離：食用菌種類很多，許多土生的食用菌;孢子不易萌發。組織分離也不易成功，用土中菌絲分離獲得純種的方法，叫土中菌絲分離。

土中菌絲分離時要注意，由於土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物，因此分離時必須儘可能避開這些微生物的干擾，儘可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接種，反覆用無菌水沖洗，在培養基中加入一些抑制細菌

生長的藥物，如

40微克/升的鏈黴素或金黴素。如發現感染細菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來，接種到木屑培養基中。因細菌沒有分解木質素的能力，因此在木屑培養基中不易擴充套件;只侷限於接種處。待菌絲長出感染區後，就可以再進行擴大提純了。

(3)子實體基部分離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體基部分離出新菌絲的方法，叫子實體基部分離，現以袋栽銀耳為例說明：

從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中;選擇生活力最強的幼耳5袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場所進行後期培養，以增強菌絲體的生活力。經培養7～10天后，待子實體直徑達4～5釐米時便可取回，作為分離的母體。再從中篩選最理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實體，放置於

0℃的冰箱或有敵敵畏的容器中過夜，以便殺死瓶中的害蟲。然後用75%酒精或昇汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質，連同接種工具、接種培養基等移進無菌室。經滅菌後，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，並進行培養。待袋口露出白色菌絲時，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結體，迅速移入母種試管培養基的中央，輕輕地脫去接種針，

塞上棉塞。

為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管，以便從中選擇。分離後應及時移入22℃—24℃恆溫箱或溫室中培養。由於培養基內水分較多，菌絲恢復要比耳木分離得快。經2-3天后，分離物的邊緣就可看

到白色菌絲。每天要至少觀察兩次，以便提純。觀察、提純方法與耳木分離法擔同。經適溫培養10-15天后，當接種塊扭結團出現紅、黃色水珠時，即可擴大原種。

(二)原種和栽培種的接種培養

母種獲得以後，為了滿足菌種生產的需要。應選出優良、純度高的母種進一步擴大為原種。

原種培養基一般採用棉籽殼、木屑、草類等培養基。

瓶裝或袋裝的原種培養基滅菌後，可送入滅過菌的接種箱內，待瓶中的培養基冷至30℃以下，可按照無菌操作程式進行接種。

菌種瓶(袋)放入培養室時，要經常進行檢查，一經發現雜菌汙染，立即取出。培養成的原種，菌絲體必須健壯有力，緊貼瓶壁而不幹縮，顏色純正，具有一定清香味，生活力強，擴製成栽培種時吃料快。

栽培種就是將原種進一步擴大培養成三級種，它和原種的接種及培養相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木、棉皮作培養基。蘑菇多用糞草做培養料。

栽培種要求料塊不脫水乾縮。菌絲體健壯有力、顏色純正，有清香味，無老化現象，無雜菌汙染，有的種許可有少量原基，接入栽培料後，發菌快，長勢好，生活力強。

原種在接栽培種時，原種瓶口的一層菌絲體應挖去不用。

(三)液體種的簡單培養

目前，用液體深層發酵法生產菌種，具有生產量大、週期短、菌齡整齊、成本低廉、接種方便等特點，是實現食用菌工廠化生產的目標。現將液體種培育過程簡述於後，供參考。

簡言之就是將純正優良的菌種，接入液體培養基(固體培養基不加凝固劑)，使菌絲繁殖形成大量小菌球，然後將這種培養基拌入木屑或棉籽皮料內，製成菌塊、培養其形成子實體。還可用於制原種、栽培種。

培養液體菌種，可將培養液裝入三角瓶中，約佔空瓶的五分之一重量。用搖瓶機(也稱搖床)來培養。搖瓶機有旋轉式和往復式兩種，一般多用往復式。液體培養基可用馬鈴薯汁(加糖)，麥芽汁配製，也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機鹽等配製。可以混合培養基，因適用於多種食用菌和藥用菌的培養，均有好效果。組分：豆餅粉2%，玉米粉1%，

葡萄糖3%，酵母粉0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣 0.2%， pH自然， 12℃滅菌半小時。然後接種培養。

如果生產量較大，在三角瓶的基礎上，再逐級擴大種子缸，發酵罐中進行液體深層通氣發酵，產生大量菌種。但由於生產中要求裝置繁多，技術性強，我們還應創造條件;實現食用菌栽培的現代化。

(四)菌種質量的鑑定

菌種質量鑑定最好的方法是，做出菇試驗。但是時間比較長。在購置菌種時，或在菌種生產中，如何能知菌絲生長情況，快速判斷菌種質量?我們介紹幾種方法：

1.肉眼觀察：優良菌種菌絲濃白，絨狀，粗壯密集，生長整齊，速度快，香味濃厚。

2.優良菌種標準可歸納為："純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時，開啟瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體，觀察色澤，聞其氣味，手捏料塊檢查其含水量，看是否符合上述要求標準。

3.顯微鏡檢查：挑取少量菌絲，置顯微鏡上觀察其形態，菌絲分枝，分隔情況，鎖狀聯合，細胞膜的厚薄。

培養觀察：從菌種瓶中挑取小塊菌絲體，接種斜面試管培養基上，置23℃～25℃恆溫中培養，經五週後檢查菌種生活力。如果菌絲生長快，旺盛純一，健壯濃厚，長且整齊，則表示菌種的生活力強。

4.分塊法：在桌上放一張白紙，把菌齡相同的菌種從瓶內取出一大塊，用手分成2塊，再把2塊分成4塊，4塊

分成8塊，依次進行。優良菌種整塊多，碎渣少。劣次菌整塊少，碎渣多。

5.液體菌種鑑別：當三角瓶或發酵缸培養3-7天后，如液麵出現氣泡，產生"油皮"、混濁等現象，說明菌種本

身帶有雜菌。如菌塊上浮，或遲遲長出很薄的菌絲層，則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀，表明菌種生命力強。

(五)菌種生產過程中的雜茵防治

在生產菌種時，要時刻注意雜菌汙染，以防為主，一旦發生，根治很不容易。所以整個制種過程都必須在無菌條件下進行。接種箱及所有分離、接種的用具、器皿，都要進行嚴格的消毒滅菌。工作人員的雙手要用消毒劑清洗，並穿戴消過毒的工作服、帽和口罩，動作要敏捷、準確，儘量不要講話走動，以防空氣中的雜菌感染。

分離母種時，選擇出菇早、生活力強，第一潮菇是關鍵，因它生活力強，接種後迅速佔領陣地，無雜菌侵入的機會。

被汙染的菌種，原因是多方面的，一般是滅菌不徹底所致，或因接種時無菌操作不嚴、瓶蓋不合適造成的。所以滅菌一定要徹底，最好在接種萌將培養基置25℃左右溫箱中做效果檢查，經2天不長雜菌，說明徹底，可以使用，接種過程中一定要嚴格無菌操作。

汙染雜菌另一個原因可能是分離母種時感染雜菌，因種菇表面帶菌，消毒不徹底，透過組織塊將雜菌帶入培養基。

總之，汙染機會很多，要注意環境消毒，按無菌操作規程徹底滅菌，層層把關，環環抓緊，嚴加註意;提離菌種質量。

首先我要選好菌種，菌類植物生長都有合適的溫度，環境，土壤，水分，菌類一般都是陰生植物，肥沃的土壤環境和充足的水分是必不可少的。

先是從土壤或腐生植物中收集含菌樣品，用無菌水稀釋後，塗布於置有適宜細菌、放線菌或黴菌生長的瓊脂培養基平皿上，並將其倒置於恆溫箱中，培養一定時間，平皿上長出的許多單個菌落（單一微生物的集落）經分別分離後即為各種純種菌株,簡稱純種,移種至試管斜面培養基上，置4℃冰箱備用。

根據不同的篩選目的，採用不同的篩選模型。如常規篩選抗生素產生菌的方法是將土壤中分離所得的純種，在含有瓊脂培養基的平皿上培養後，用打孔器將菌塊移至含有試驗菌的瓊脂培養基上，在適宜的溫度下培養一定時間後取出，如在菌塊的周圍有透明的抑菌圈，則表明此菌種具有產生抑制試驗菌生長的抗菌物質的能力。所得菌種經過搖瓶液體發酵，測定發酵液或菌絲體內抗生素的含量，選出生產能力高的菌種。另一方面對所提取的抗生素進行結構分析、藥理試驗及臨床試驗等，確為有效者，即可作為生產菌種。又如篩選脂肪酶生產菌種的方法是將分離所得的黴菌塗布於含有牛脂的瓊脂培養基上，恆溫培養一定時間，如菌落周圍出現透明圈的，則該菌具有分解脂肪的能力，進一步作搖瓶發酵測定酶活力，挑選產量高者作生產菌種的出發菌株。

即採用遺傳育種的方法，使野生型菌株(從自然界分離篩選而得的出發菌株)的遺傳因子 DNA發生突變、重組，從而從中選出產量高、成品質量好或具有新的培養特性如耐產物抑制、能利用廉價原料以及具有生產新品種能力的優良菌種。採用的方法有誘變育種、雜交育種、細胞融合技術和重組DNA技術。誘變育種是利用誘變因子如紫外線、鈷－60、乙烯亞胺類等物理或化學誘變劑處理生產菌株的單孢子懸浮液，以獲得誘發突變株。隨後進行突變株的篩選，從中篩選高產菌株。由於隨機的突變群體中，有益突變所佔比例很低，要獲得高產突變株必須進行大量篩選。近年來，隨著發酵代謝控制研究的發展,可根據生物合成途徑中的反應點,並透過它們的改變以提高產率或其他特性，如選育抗產物反饋抑制的突變株、增加細胞透性的突變株及營養缺陷型的突變株等。這種“理性篩選法”廣泛應用於氨基酸產生菌的選育。

接種後的各級菌種，都應放在適宜其生長的條件下進行培養。母種一般在恆溫箱中培養，只有數量過多時才在可控溫的小型培養室培養。將恆溫箱調至菌種生長繁殖所需要的溫度，恆定後即可放人母種，如果在一個恆溫箱中同時培養兩種以上、菌絲生長溫度相同的菌種，就應在試管上貼上菌種名稱的標籤，防止混雜，菌絲布滿培養基斜面，即可轉接原種。原種和生產種數量較大，接種後立即放人培養室的培養架上，最初應豎直放置，待菌種萌發生長，向四周蔓延，菌絲封住培養基後，就應倒架改豎放為橫放，並可重疊，這樣一方面節省空間；同時，直立擺放培養基水分容易在瓶底沉積，底層水分過大空氣相對減少，影響菌種生長。橫放時要經常轉動菌種瓶，可調節瓶內上下水分，有利菌絲生長。此外豎放時，培養基水分向上蒸發，瓶塞容易吸潮和積塵，易引起雜菌汙染。

我個人認為，做好以上幾點，可以培養出強而穩定的菌種。主要還是細節上要做到位，要達標。

質粒的複製數

質粒複製數是指在特定培養基中一個細菌細胞中質粒的個數。這個數字主要由質粒的複製起點（replication origin）決定，同時也受到插入片段的大小和性質，菌種，生長條件等因素影響。

如果手頭上的質粒是個低複製的質粒，那麼最簡單的提高產量的方法是用更大的培養體積和更多的試劑盒來抽提。在抽提的過程中可以用更大的裂解液體積進行純化，但是注意不要超過了試劑盒說明書上標明的上限。對於某些質粒，如p15A, ColE1複製原點的，可以在培養基中新增氯黴素來增加質粒的複製數。

菌種

市面上有很多種商業化的菌種可用於擴增和純化質粒DNA，但是也增加了選擇的難度。根據用途選擇菌種也不是那麼簡單的事情，比如說HB101及其衍生菌株適合長期儲存質粒，但是這個菌株會產生糖類物質會影響細胞的裂解效率和質粒的產量。再比如，Stbl3菌株可以極少的產生DNA重組，很適合用於擴增不穩定的質粒，但是他們的基因型是endA+的。endA 編碼一個熱穩定性的周質核酸內切酶，如果在純化的過程中去除不乾淨，那麼EndA會切斷提純的質粒，電泳檢測的時候呈現smear狀。DH5alpha菌是一個很好的質粒擴增質粒，因為他是endA1, recA1, relA1基因型的。這三個基因的突

變提高了質粒的穩定性，產量。選擇哪個菌株，還是要看你的用途，檢視菌株的基因型來看看是否適合。

，抗生素和接種物

培養條件在質粒的產量中發揮重要作用，如下圖所示，不同的培養條件會極大的影響質粒的產量。

對許多高複製的質粒來說，標準的LB培養基和正常的抗生素工作濃度就已經足夠了。然而對許多低複製的質粒和生長緩慢的菌株來說，更改培養基組分可能是個不錯的選擇。低複製的質粒用更低的抗生素濃度可能會比較合適。

另外，可以用富營養的培養基來獲得更高的菌密度，這些培養基有Terrific Broth, 2xYT， H15等。在培養基中加入鎂鹽，緩衝液，和/或碳源如甘油、葡萄糖也會增加菌密度和質粒產量。為了達到最優的效果，推薦挑取新鮮克隆來進行接種，而不是用甘油菌做為菌種（有可能質粒丟失）。

時間，溫度和通氧條件

最後，最佳化培養時間，溫度和搖床的轉速來提高菌密度和質粒產量。對於典型的高複製質粒來說，培養時間一般在12-16個小時。而低複製質粒則需要培養20小時甚至更長。對於不同的質粒和菌株，需要單獨最佳化，可以透過檢測OD來測試。

另外，有些菌種的最適生長溫度不是37度，這個在菌種說明書上一般會有註明。最後值得注意的是通氧條件，培養基的體積不要超過培養瓶體積的四分之一。一般大瓶轉速在220RPM就夠了，而小瓶則需要更高的轉速，比如260-300 RPM。