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RAPD:用一個(有時用兩個)隨機引物(一般8-10個鹼基)非定點地擴增基因組DNA,然後用凝膠電泳分開擴增片段。AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產生的擴增產物的多型性。
RAPD:用一個(有時用兩個)隨機引物(一般8-10個鹼基)非定點地擴增基因組DNA,然後用凝膠電泳分開擴增片段。AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產生的擴增產物的多型性。
RAPD技術是建立在PCR技術的基礎上,它用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基序列的寡核苷酸單鏈(一般為10個bp)作為引物,對所研究的基因組DNA進行單引物擴增。模板DNA經90—94變性 解鏈後在較低溫度(36~37℃)下退火,這時形成的單鏈模板會有許多位點與引物互補配對,在 72℃下,透過鏈延伸,形成雙鏈結構,完成DNA合成。重複上述過程,即可產生片段大小不等的擴增產物,透過電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶,從中 篩選出特徵性條帶。擴增產物片段的多型性反映了基因組DNA的多型性。如果基因組在這些區域內發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合 位點的分佈發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。因此,透過對PCR產物的檢測即可測出基因組DNA在這些區域的多型性。進行 RAPD分析時,可用引物的數量很大,雖然對每個引物而言,其檢測基因組DNA多型性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基 因組。因此,RAPD可以對整個基因組DNA進行多型性檢測。 RAPD技術的優點: ①不使用同位素,減少了對工作人員健康的危害; ②可以在物種沒有任何分子生物學研究 的情況下分析其DNA多型性; ③對模板 DNA的純度要求不高; ④技術簡單,無需克隆DNA探針,無需進行分子雜交; ⑤靈敏度高,可提供豐富的多型性; ⑥RAPD引物沒有嚴格的種屬界限,同一套 引物可以應用於任何一種生物的研究,因而具有廣泛性、通用性。 但是,RAPD技術較易受到各種因素的影響。無論是模板的質量和濃度,短的引物序列,PCR的迴圈次數,基因組DNA的複雜性,技術裝置等,都有可 能是RAPD技術重複性差的直接原因。目前,多從以下幾個方面來提高反應的穩定性: ①操作規範,反應體系的組成要力求一致,儘可能地使RAPD反應標準 化; ②提高擴增片段的解析度; ③將RAPD標記轉化為SCAR標記後再進行常規的PCR分析,可以提高反應的穩定性及可靠性。