某些為催化活性所必需的，與酶蛋白疏鬆結合的小分子量的有機物質。

一部分酶除蛋白質部分外，尚含有與它們的功能直接有關的一些無機或有機成分，這些成分統稱為酶的輔因子，如果缺少這些成分，酶就顯不出活性。

輔因子包括金屬離子和一些分子量不大的有機化合物。一般常見的金屬離子有鋅離子(Zn()、鎂離子(Mg()、鐵離子(Fe()、銅離子(Cu()等，例如醇脫氫酶含鋅、精氨酸酶含錳、而多酚氧化酶則含銅等。

與酶蛋白結合很鬆弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開的稱為輔酶（Coenzyme）——還有啟用劑與輔基之分（見文章的最後，此不表）。輔酶儘管不同於酶的底物，但在作用方式上和底物類似，在酶反應過程中與酶結合、分離及反覆迴圈。輔酶用量的確定可將它們按底物處理。例如乳酸脫氫酶中輔酶按雙底物動力學方程計算。

有不少酶既含有金屬輔因子也含有輔酶。許多輔酶是或維生素的衍生物。

作為輔酶的B族維生素及其衍生物　20世紀前 50年在維生素研究中的突出成就就是分離和鑑定了許多維生素（特別是 B族維生素）並闡明瞭它們在人體內的作用。發現不少維生素類 (特別是B族維生素或其衍生物)是有機體中一些重要酶類的輔酶，它們的需要量雖不多但必須從食物中攝取。