當然不是一種了，我們可以根據需要和實際情況來自己選擇。

首先，在構建重組質粒的時候，我們首先得了解所用的質粒多克隆位點有哪些切割位點。這個可以透過查詢載體的圖譜來檢視只要圖譜中有的位點，那都是可以用相應的限制酶來進行切割。一般不要使用平末端的酶切位點，因為結合效率比較低。除了特殊情況，才會選擇平末端位點。

其次，我們要了解哪些酶切位點是比較常用的，哪些成功率高，效率高。然後檢查我們的目的基因內部中是否存在這些酶切位點。如果基因內部含有你想用的酶切位點，那就需要更換，不然會把目的基因切割掉。那就更換其他的，反正就在常用的酶中選擇兩個，同時要避免基因內部含有酶切位點。關於這個，可以透過軟體去分析，最常用的就是DNAstar，使用很簡單，功能很強大。

最後就是設計引物，在設計引物的過程中，需要把上下游引物兩端新增上你選擇好的酶切位點。透過引物去擴增目的基因，同時，帶上了酶切位點。這裡需要注意的是，在新增酶切位點的時候，一定要把上下游搞清楚，初學者是有可能看反上下游的。

不一定，同一種酶處理載體，只有一種粘性末端，而兩種以上的酶處理載體可以得到不同的末端以匹配不同的片段，你可以使用snapgene等軟體構建質粒圖譜，確定最終的酶切方案。