2.在模板（Template） 在“PCR Template”下面的文字框，輸入目標模板的序列。

3.然後在Primer Parameters區填入你的一條或一對引物。並且選擇好驗證的目標資料庫（在specificity check區選擇）。根據需要可設定產物的大小，Tm值等。

4.選擇設計引物或驗證引物時的目標資料庫和物種。

5.作為標準來設計引物時，Primer-BLAST可以設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。

參考資料:Primer-BLAST是NCBI的引物設計和特異性檢驗工具。線上設計用於聚合酶鏈反應（PCR）的特異性寡核苷酸引物。免除了用另一個站點或工具設計引物的步驟，設計好的引物程式直接用Blast進行引物特異性驗 證。

NCBI中primer-blast使用方法？

Q-PCR是生物學研究中的一項重要技術，用以檢測基因表達的變化。其原料之一引物是需要研究者根據自己的研究物件進行設計的，這裡介紹在NCBI裡設計Q-PCR引物的方法。

1、首先開啟NCBI，選擇“Nucleotide”，並在搜尋框輸入基因名。一般用目標基因的突變體1去設計引物，也就是要選擇目標基因的“transcript variant 1, mRNA ”,沒有1就用2、3，以此類推。因為是Q-PCR，所以要去掉內含子，因此用mRNA。

5、從第二步的頁面複製序列或者序列號，貼上在第一個框裡。修改產物長度，即“PCR product size”,一般為100-200之間最好。還要選擇“Exon junction span”為“primer must span an exon-exon junction”,這是為了排除DNA汙染。其它的引數都可以不改。

7、最後一步就是選擇引物了。要選擇自我配對和互相配對度低，產物長度儘量小的等等。需要指出的是，要注意看引物對非目標基因的檢測潛力，如果它對於目標基因相似基因擴出的產物長度與目標產物長度一樣長，這個引物的非特異性就很強，不能要。