1、引物自身及引物之間不應存在互補序列。連續互補的鹼基應該要少於4 個。引物應使其△G 值不要太高，△G 值越大，則雙鏈越穩定。

2、引物長度和GC 含量要適中。引物長度大概為18~28 bp，但不應大於38 bp，引物過短會影響到擴增的特異性，太長的話其延伸溫度將會大於74 ℃，不利Taq 酶的催化反應。若擴增產物為4~5 kb，引物最好不要少於24bp；如果目的產物≤500 bp，引物長度只要16~18 bp 即可。上下游引物間的Tm 值的差值最好在10 ℃以內，GC 含量最好是40%~60%。

3、3′端不應該存在相似性高的序列，否則容易導致錯配。3′端不能有多於3 個連續的G 或C，要不然引物錯配會在GC 富集區。

4、引物3′端不能修飾，5′端可以修飾，還儘量要避開密碼子第3 位。同時要注意選擇3′端△G 值相對較低，5′端和中間△G 值較高的引物。

1、首先要拿到自己要設計引物的目的基因。這裡我使用一段GFP基因給大家講解。將目的基因儲存在txt文件裡面，或者直接複製下來後在DNAMAN裡面新建文件複製進去。下面是我們要設計引物的GFP基因序列。如圖所示。

2、開啟DNAMAN，選擇選單裡面的Primer-->Load Primer-->From Input。將上一步中的目的基因序列從開頭開始的20個左右的鹼基複製貼上進去(引物長度要在15—30bp之間，常用的是18-27bp)，比如我們先試試前20個鹼基是否合適，將ATTGATGTGATATCTCCACT這20個鹼基複製貼上進去，點選OK。如圖所示。

4、Tm值一般在55℃到70℃之間比較好，PCR儀的退火溫度一般設定比primer的Tm低5℃（不過一般情況我們都設定為55℃，因此Tm值在60左右比較好）。如圖所示。

5、從上圖可以看到我們這20個鹼基的Tm值只有49度，顯然太低，需要增加鹼基數量。我們取前24個鹼基貼上進去，便可以看到這個引物的Tm值，發現是60.3度，很合適，就用這個了。這樣正向引物就設計完了，把這24個鹼基序列儲存下來。如圖所示。