1. 脂肪酸的活化：脂肪酸生成脂醯輔酶A，由脂醯輔酶A合成酶（硫激酶）催化，線粒體中的酶作用於4-10個碳的脂肪酸，內質網中的酶作用於12個碳以上的長鏈脂肪酸。

2. 轉運：短鏈脂肪酸可直接進入線粒體，長鏈脂肪酸需先在肉鹼脂醯轉移酶I催化下與肉鹼生成脂醯肉鹼，再透過線粒體內膜的移位酶穿過內膜，由肉鹼轉移酶II催化重新生成脂醯輔酶A。最後肉鹼經移位酶回到細胞質。

3. β-氧化：線上粒體基質進行，每4步一個迴圈，生成一個乙醯輔酶A。

1）脫氫：在脂醯輔酶A脫氫酶作用下，α、β位生成反式雙鍵，即Δ2反式烯脂醯輔酶A。酶有三種，底物鏈長不同，都以FAD為輔基。生成的FADH2上的氫不能直接氧化，需經電子黃素蛋白（ETF）、鐵硫蛋白和輔酶Q進入呼吸鏈。

2）水化：由烯脂醯輔酶A水化酶催化，生成L-β-羥脂醯輔酶A。此酶只催化Δ2雙鍵，順式雙鍵生成D型產物。

3）再脫氫：L-β-羥脂醯輔酶A脫氫酶催化生成β-酮脂醯輔酶A和NADH，只作用於L型底物。

4）硫解：由酮脂醯硫解酶催化，放出乙醯輔酶A，產生少2個碳的脂醯輔酶A。酶有三種，底物鏈長不同，有反應性強的巰基。此步放能較多，不易逆轉。

脂肪細胞沒有甘油激酶，所以甘油被運到肝臟，由甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油，再由磷酸甘油脫氫酶催化為磷酸二羥丙酮，進入酵解或異生，並生成NADH。