菌種分離即是進行食用菌菌絲的純化過程，它是制種工作的重要環節，通俗地講就是把食用菌菌絲從自然界中單獨分離出來進行純培養，從而獲得純食用菌菌種的過程。菌種分離是一項重要而又細緻的工作，每一個環節都必須嚴格按無菌操作規程進行。食用菌的分離方法很多，常用的有組織分離法、孢子分離法和基內菌絲分離法三種。

1）組織分離法

組織分離法是將食用菌的部分組織移接到斜面培養基上獲得純培養的方法。其特點：一是屬於無性繁殖，能保持原有菌株的優良特性，是生產中獲得純菌種的常用方法，且簡單易行，取材廣泛，菌絲萌發快。二是組織分離法操作簡便，又不易帶入雜菌，容易獲得純菌種。但對銀耳、黑木耳等膠質菌因其子實體中菌絲的含量極少，如用組織分離培養，則往往不易成功。

（1）子實體分離　種菇要選朵大蓋厚、柄短、八九分成熟的優良品種。切去菇體基部，在無菌箱內以0.1%的昇汞水浸幾分鐘，再用無菌水沖洗並擦乾或用75%的酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進行表面消毒。接種時，只要將種菇撕開，用消毒後的小刀在菌柄與菌蓋交接處切去一小塊組織，用接種針將組織塊放入PDA培養基的試管斜面中間。置25℃左右溫度下培養3～5d，就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲，轉管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。

（2）菌核組織分離　茯苓、豬苓、雷丸等食用菌的子實體不易採集。而常見的是它儲藏營養的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗淨，用消毒酒精或昇汞消毒後，切開菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA培養基斜面上，在20～25℃下培養，產生菌絲後進行分離純化。應注意的是，菌核是儲藏器官，大部分是多糖類物質，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，如果組織塊過小，則不易分離出菌種。

（3）菌索分離　菌索分離常用於密環菌分離。方法是選新鮮的活菌索，用75%酒精棉球將菌索表面消毒後，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用無菌剪刀剪成小段，接入PDA試管斜面培養基上，在20～25℃下培養，有白色菌絲長出且無汙染，即表明分離成功。

2）孢子分離法

孢子分離法是利用成熟子實體的有性擔孢子能自動從子實體層中彈射出來的原理，在無菌操作條件下，使孢子在適宜的培養基上萌發長成菌絲體而獲得純菌種的一種方法。這種菌種生活力較強，但孢子個體之間有差異，且自然分化現象較嚴重，變異大，需經出菇試驗才能在生產上應用。其特點一是屬於有性繁殖，後代易發生變異，可用此法培育新品種。二是分離過程較複雜，適用於膠質菌類和小型傘菌。孢子分離可分為單孢分離法和多孢分離法兩種。

（1）單孢分離法：取單個擔孢子接種在試管斜面培養基上，讓它萌發成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲有結實能力，可採用此法分離生產純菌種。單孢分離生產上較少採用，而且技術複雜，一般採用多孢分離法。

（2）多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養基上，讓它們萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。操作簡單易學，生產上經常採用。由於採集孢子的方法不同又分為如下幾種。

①採集器孢子彈射法　採集孢子的裝置可用玻璃鐘罩或玻璃漏斗做成（圖9）。蘑菇和香菇常用這種方法採集孢子。具體做法是：把玻璃鐘罩或玻璃漏斗，放在一個墊有幾層紗布的瓷盤上，內放培養皿和不鏽鋼支架（漏斗內也可倒掛鐵絲代替支架），上端通氣孔用棉花塞住，然後用兩層大紗布將整個裝置包起來，高壓滅菌後，移入無菌室備用。分離時把選好的種菇（八九分成熟），切去菌柄基部送入無菌室，用0.1%～0.2%的昇汞溶液或75%的酒精表面消毒1～2min後，放在無菌水中漂洗，除去表面藥液，再用滅菌紗布擦手，並將其插到不鏽鋼支架上或鐵絲鉤上，靜置1～2d，菌褶上的孢子大量散落到培養皿內，形成一層粉末狀孢子印時，取下種菇，用滅菌後的注射器，吸取3～5mL無菌水，注入盛有孢子的培養皿中，輕輕攪動，使孢子均勻地懸浮於水上，再將注射器插上針頭，吸取沉於底部的飽滿孢子，注1～2滴懸液於試管斜面培養基，並使其均勻分佈於培養基表面。或用接種環挑取少量的孢子直接在斜面培養基上畫線。待孢子萌發，生成菌落時，選孢子萌發快，生長良好的菌落，移接到新的斜面培養基上培養。

②三角瓶懸掛法　銀耳、黑木耳常用此法採集孢子。以銀耳為例，其具體做法如下：選朵大、雪白、無病蟲害的新鮮銀耳作為種耳，用75%的酒精棉球擦拭子實體表面，經無菌水沖洗種耳數次後，用無菌濾紙把種耳表面的水分吸乾。用滅菌刀把種耳切成一小塊，以入瓶後不會碰到瓶壁為度，掛在用火焰滅菌過的小金屬鉤（或不鏽鋼鉤）上，迅速懸掛在三角瓶內，注意勿使種耳接觸到培養基，以防雜菌汙染（圖10）。塞上棉塞，放在20～25℃條件下，經1～2d，就可看到培養基上形成一個霧狀孢子印。此時，以無菌操作把懸掛瓶內的耳片取出，再塞上棉塞，移到20～25℃的室中培養，經2～3d，培養基表面就會出現許多乳白色糊狀的菌落，就是銀耳的分生孢子。

④褶上塗抹法　適用於野外採種，方法簡便，效果也好，按無菌操作分離時應選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子，再在培養基上畫線接種。

採用孢子分離要注意控制培養的溫度。因為食用菌孢子的彈射與培養的溫度有密切關係，如雙孢蘑菇孢子彈射最適溫度是14～18℃，培養在25℃條件下，孢子就很難彈出。一般食用菌孢子彈射的最適溫度比菌絲體生長的最適溫度低，而與子實體發育的最適溫度大致相同。如香菇孢子彈射的最適溫度為12～18℃，銀耳為20～24℃，黑木耳為20～26℃，平菇為13～20℃。

孢子分離得到的母種必須進一步提純復壯，當母種定植一星期左右菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜菌的母種試管，進而轉管擴大，一般到栽培種轉管不宜超過5次。

孢子分離得到的母種必須通過出菇試驗，鑑定為優質菌種後才可供生產使用。一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分離法獲得母種。

3）基內菌絲分離法

基內菌絲分離法是利用生長食用菌菌絲的基質作為分離材料進行分離的一種方法。屬於組織分離法中的一種。在食用菌生產上主要是利用栽培袋（瓶）、菌床培養料、段木等作為基內菌絲分離物件，如果是袋（瓶）的材料，多選用袋（瓶）底部菌絲較幼嫩的部分進行分離。分離時取一塊無汙染的菌絲塊，在無菌條件下掰開菌絲塊，從中挑取綠豆大小、菌絲生長旺盛的菌絲塊，移入試管即可。如果是菌床宜選擇內部無汙染的菌絲塊。特別是銀耳、黑木耳採用這種方法，成功率高，性狀也較穩定，是生產上經常採用的方法。具體做法是從野生或人工栽培的場所選擇子實體發生早、生長旺盛、朵大、無病蟲害的菇木或耳木，鋸取一小段，讓其充分風乾後備用。分離時如為香菇的菇木，先鋸取1cm的薄片，切去四周用0.1%昇汞水錶面消毒1～2min，用無菌刀將其劈成小木片，再切成0.5cm2的小木條，移入試管斜面培養基上，經25～27℃培養，菌絲生長後，再轉管培養。

分離時如為銀耳的耳木，先從長有子實體部位，鋸取1～2cm厚的木片，剔除樹皮及耳基，再用0.1%昇汞水或70%酒精塗擦表面消毒，透過耳基著生處，把耳木縱切為二，用無菌刀在耳基著生處，削取極小的木屑，移入試管斜面培養基上。接種後放在20～28℃的溫度下培養，數天後接種塊的周圍開始長出纖細的白色菌絲，延伸到培養基後，培養基的顏色逐漸變黃轉黑，表面出現淺灰色斑紋，這就是羽毛狀菌絲。一星期後，小木屑上出現白色短絨毛狀菌絲，同時分泌白色或淡黃色水珠，這就是銀耳的發育菌絲。挑取銀耳發育菌絲和少許羽毛狀菌絲轉接於新的斜面培養基上進行擴接，一星期後，菌絲長滿試管，即成為母種。在實際分離中往往不可能得到銀耳菌絲與羽毛狀菌絲兩者兼有的母種。或純為銀耳菌絲；或純為羽毛狀菌絲；或為酵母狀分生孢子，還有相當數量是感染雜菌或不長任何菌絲的。純銀耳菌絲和純羽毛狀菌絲經適當配合後，就可應用於生產。

黑木耳的耳木分離，其操作方法與銀耳大致相同，但不像銀耳有多種型別的菌絲。耳木接入試管後，一般放在22～28℃條件下培養2～3d可見菌絲長出。選生長健壯、清楚、兩端整齊的，進行轉管純化2～3次即可培育成母種。在培養過程中，有時培養基背面會出現乳白色或淡褐色，這是正常現象，其特點是易感染雜菌。基內菌絲分離法一般只在下列情況下采用：①子實體已腐爛，但又必須保留該種菌種；②有些子實體小而薄，用組織分離法和孢子分離法較困難；③還有一些菌類如銀耳菌絲，只有與香灰菌絲生長在一起才能產生子實體，如果要同時得到這兩種菌絲的混合種，也只能採用基內菌絲分離法進行分離。

4.菌種的純化

一級菌種的純化是指對分離獲得的菌種進行再提純，成為生產所需要的菌種的方法。在實踐中，無論採用哪種分離方法，都不排除雜菌汙染的可能性，如果已確定被汙染可以採取以下措施純化。

（1）菌絲的再提純

正常的菌種在固體培養基上，菌絲逐漸向四周呈輻射狀生長，邊緣整齊一致，菌絲濃密健壯。如果被雜菌汙染，則菌絲生長不一，菌落邊緣參差不齊，培養基內會產生各種色素，併發出臭味。如果需要採用這種菌種，就必須進行再提純。再提純時，可選用菌落生長速度較為一致的菌絲體作為再提純物件，用消毒的接種鏟切取菌絲的前端部分（連同培養基一起），轉移到新的培養基上培養。如果菌絲生長稀疏，如草菇，也可採用單根菌絲分離法，即在顯微鏡低倍鏡下選擇單根菌絲，用鋒利的接種針，仔細地將貼在固體培養基上的單條菌絲帶小量培養基切下，移到新的培養基中培養。經過幾次的切割移植，逐漸挑選生長良好的無雜菌菌株，從而獲得純菌種。

（2）汙染物的排除

在菌種分離後，細菌、黴菌的汙染時有發生，必須加以排除。一般來講，被雜菌汙染的菌株不再使用。但有時由於菌種緊缺，並且汙染物不多，也可用滅菌濾紙浸在1%的多菌靈溶液中，然後取出覆蓋於黴菌的生長點上，以防止分生孢子的擴散，然後用接種鏟切取一小塊遠離雜菌的健壯菌絲移至新的斜面培養基上培養。如果是細菌汙染，細菌的菌落比較侷限，並不會出現細胞飛揚現象，因此，可以先用接種鏟將細菌菌落連同培養基一起取出來，再從無菌部位取菌絲塊轉管一次，同樣可以獲得純菌種。

母種的培養：香菇“母種”是指利用香菇的孢子、組織（菇肉）或菇木分離培養而成的菌種。香菇母種的培養，用馬鈴薯和洋菜做培養基。培養基的製作配方為：去皮的馬鈴薯（或甘薯）200克、葡萄糖（或蔗糖）20克、洋菜20克及水1千克 。按上述比例，把已去皮的馬鈴薯洗淨切碎後，放入鍋中加水適量煮沸20—30分鐘，用幾層紗布過濾去渣，把濾液加水至足量，再加入洋菜和葡萄糖，並加熱使之融化。接著趁熱分裝到試管中，管口塞上棉花並束紮成捆，包上牛皮紙，立置在高壓鍋內，在15磅壓力下維持30分鐘，或放在蒸籠中蒸2—3次（每日一次，每次一小時），同樣能達到滅菌的目的。將滅過菌的試管趁熱斜置在桌子上，待凝固後即成。

母種的培養要選擇出菇早，朵形正常，菇蓋厚，菇柄短胖，無病蟲害，7—8釐米成熟的香菇，放入接種箱（無菌箱）或接種室（無菌室）中，用刀片刮下表皮後，取乾淨無菌的菇肉約一粒綠豆大，用接種針接到上述培養基上，一管一塊即可。將接種後的試管置於25—27℃環境（保溫室或溫箱）中培養，2—3天后在接種塊四周，就長出孢狀的白色菌絲。（試管內如發現有綠色、黑色等雜色菌或酵母狀東西，說明其中有雜菌，應把它淘汰掉。）約培養半個月後，菌絲體就佈滿洋菜表面，母種培養即告成功。在分離和接種時，所用工具均需經滅菌處理。母種移到新的培養基上，進行擴大培養一般稱之為“原種”。用作直接種到段木上去的菌種，一般稱為栽培種。

適合香菇生長的各種硬質什木的幹木屑7.5千克，米糠或麩皮2.2千克，蔗糖0.15千克，石膏粉0.15千克及水15千克。按上述比例，把木屑、米糠先拌勻，把蔗糖和石膏粉溶在10千克水中，然後倒入上述混合物中和勻，再將餘下的5千克水加入調勻隨即分裝到菌種瓶中，至近瓶肩，稍壓實（下部稍松，上部稍實），再用尖形木棒鑽一個直達瓶底的洞孔。然後瓶口塞上棉花塞，並用牛皮紙紮起棉花塞，移到蒸蘢中續蒸4—6小時（從水開算起，火要猛）、或放在高壓鍋中，在15磅壓力下維持1小時，進行滅菌。滅菌後，取出冷卻，即可用來接種。接種過程要在無菌條件下操作，用接種針挑取經過擴大培養的原種1小塊，接種在上述的木屑培養基上，接種後把它放置在25—27℃環境中培養一個月左右（或20—25℃培養1—2個月），待菌絲體長滿全瓶後，即可接種到段木上去。

香菇的種木菌種，主要是三角木和圓木兩種。三角木是把適合種香菇的木材加工成厚0.8釐米、寬1釐米的木條，然後再加工成三角木塊（規格是：厚0.8釐米、寬1釐米、高1—1.5釐米）。圓木是先把木材橫鋸成1.2釐米的木片，再用皮帶衝一個一個衝下來。加工出來的三角木或圓木，應立即曬乾備用。做10千克幹種木用的培養基，要配木屑2千克，米炕（或麩皮）1千克、蔗糖0.1千克、石膏粉0.1千克、水4.5千克。先把幹種木浸在1%糖溶液中12—24小時或放在鍋中煮開15—20分鐘後，撈出種木，與四分之三的混合物拌勻，並隨即分裝入菌種瓶（或其它瓶）、用餘下的四分之一蓋面，裝至瓶肩、稍壓實、壓平，塞上棉花塞，其消毒接菌和培養方法與木屑菌種同。經一段時期培養後，即成為三角或圓木菌種。

野生香菇是可以分離出菌種的，但分離出的菌種是不是能夠成活，能夠成活，是否在人工種植中，能夠適應人工模擬的生長環境，也具有著不確定性。如果要它成為人工種植中能使用、並且具有優良的抗性、出菇效能、產量效能、質量效能還需進行無數次的馴化，馴化成功才能做為新品種進行推廣使用。

對野生香菇進行分離並不難，其中最容易的就是採用組織分離法。所謂的組織分離法，簡單的說就是利用香菇組織能再生菌絲的特性，取一塊香菇的新鮮組織，放進裝有培養基的試管中，再把試管放置在適於香菇菌絲體生長的恆溫環境中，進行菌種培育，詳細操作步驟如下。

一，PAD培養基製作。

用組織分離法制作菌種，必須先製作好PDA培養基備用。

【1】所用原料。

馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15克、水1000毫升。

【2】製作。

馬鈴薯洗淨去皮，切成小顆粒，放入鋁鍋中，加入1000毫升水，進行蒸煮至沸騰。沸騰狀態下保持30分鐘後，關火。用三層以上紗布對鍋中的馬鈴薯進行過濾，把經過過濾得到的馬鈴薯溶液倒入量杯中。

接著，把葡萄糖、瓊脂放入量杯中，並把量杯中的水補足1000毫升後，進行攪拌均勻，使葡萄糖和瓊脂充分溶解。如溶液溫度過低，不能充分溶解，可對量杯進行加熱，直至全部溶解。

【3】灌裝試管。

就是把調節好的培養基趁熱用漏斗灌裝進早就準備好的試管中，灌裝量是試管容積的1/5~1/4，灌裝完畢，試管蓋緊膠塞，每7支為一組為一組進行捆紮。

【4】滅菌。

把試管放進高壓滅菌鍋中進行滅菌。滅菌溫度121℃、壓力0.105Mpa，滅菌時長30分鐘，滅菌過程中，要注意排淨高壓滅菌鍋中的冷氣。滅菌後，鍋內溫度降至80℃時，放淨鍋中蒸汽，取出試管。

【5】擺放試管斜面。

滅菌鍋中取出的試管放置在平臺上，試管開口端用物墊起，讓試管內培養基形成斜面，使試管內培養基最高處處於試管的1/2位置，試管上覆蓋毛巾或棉墊類物品，避免試管內出現冷凝水。試管中的培養基凝固，試管斜面培養基製作完成。

【6】雜菌測試。

把製作好的培養基試管，放入25℃的恆溫箱內，48小時後，顯微鏡檢測，培養基上無雜菌生長，低溫儲存培養基試管待用。

二，分離香菇組織。

就是取下新鮮野生香菇的一塊組織，組織摘取要在無菌條件下進行。

【1】消毒滅菌。

用75%酒精對整個香菇菇體表面進行擦拭後，拿入經消毒滅菌的接種箱，並再次用75%酒精進行表面擦拭後，點燃酒精燈，把香菇菇體一撕為二，把手術刀在酒精燈上進行火焰消毒冷卻，然後切下香菇組織。

【2】摘取。

用於菌種培養的香菇組織摘取，一般摘取位置選擇在菌柄和菌褶交匯處，此處組織的細胞再生能力最強。組織大小，取下組織塊的大小近於綠豆粒大小即可，摘取完畢，放入試的培養基上。為了成功率，一般一次培養數量，至少在7支試管以上。

【3】培養。

把裝有香菇組織的培養基試管，放進恆溫箱內，溫度調節在25℃左右。1周左右，如果香菇組織表面，長出絨毛狀菌絲，即視為成活。如組織表面沒有任何變化，表明分離失敗，只能重新進行分離。

在恆溫箱中，對成活的菌絲再培養2周左右，進行一次轉管，如轉管後菌絲成活，就是得到了野生香菇的母種。

得到野生香菇母種後，要進行進一步的篩選，留出菌絲生長最為強壯的母種，進行原種種擴繁後，進行栽培實驗和人工馴化，人工馴化獲得成功後，證明一個新的香菇品種誕生，即可以進行擴繁原種、栽培種，進行栽培。如進行推廣，需到相關部門註冊、辦理資質，才可進行。

野生香菇的菌種分離，說起來容易，成活應該問題不大，最主要在分離後的人工馴化，能夠馴化成功，才能成為真正的菌種。經歷馴化過程時，要做好所有的心裡準備，辛苦不必提及，最主要是要有接受失敗的勇氣，不氣餒、不灰心，不達目的不罷休的的堅定信心。