石蠟切片
石蠟切片(固定切染色)步驟
VIP專享文件 2018-06-30 7頁
石蠟切片染色
1、 器材
切片刀，切片機，恆溫箱，溫臺，熔蠟爐，蠟杯，酒精燈，蠟鏟，展片臺，解剖刀，解剖針，解剖剪，解剖盤，培養皿，吸管，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤，樹膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計，臉盆，水浴鍋。
2、 試劑
卡諾氏固定液、FAA固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、埃利希蘇木精染液， 1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，郝普特氏粘片劑，中性樹膠。1%番紅，1%固綠，1%過碘酸，Schiff試劑，0.5%偏重亞硫酸鈉溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%~1%澱粉糖化酶溶液。
3、 材料
鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、莖、葉等。
4、 每個實驗小組的用量
(一)器材
切片機，切片刀，溫臺，恆溫箱，熔蠟爐，水浴鍋等這類幾個小組用一臺就行；解剖刀，單面刀片，小臺木，毛筆一隻，蠟鏟一個，蓋玻片和載玻片30個，臉盆一個，酒精燈各一個，包埋紙盒2~3個，染色缸一個，瓷杯3個，顯微鏡一臺。
（二）試劑
FAA固定液50ml、1%番紅100ml、1%固綠100ml、1%過碘酸100ml、Schiff試劑100ml、亞硫酸鹽300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%澱粉糖化酶溶液200ml，石蠟半盒、蜂蠟10塊、埃利希蘇木精染液100ml、1%伊紅酒精溶液100ml、1%鹽酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片劑數滴，中性樹膠數滴。
（三）材料
小白鼠一隻、蠶豆種，小麥和大豆種10~20粒，洋蔥和大蒜由實驗室統一種，然後取其所需部分。
石蠟切片法例項（一）
—蘇木精-伊紅對染法
一、目的要求
1、 熟悉石蠟切片的製作過程。
2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法。
二、實驗原理
石蠟切片是最基本的切片技術，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用範圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便於全面觀察組織構造，而且適用於各種固定液固定的材料，染色後不易褪色可長期儲存。經過HE染色，細胞核被蘇木素染成藍紫色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。
三、實驗用品
（一） 器材
切片機，切片刀，溫臺，恆溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小臺木，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。
（二） 試劑
卡諾（Carnoy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸乙醇液，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯
，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。
試劑
配法：
1、卡諾氏固定液：
100%酒精3份
冰醋酸 1份
或：100%酒精6份
氯仿 3份
2、埃利希蘇木精染液的配法：
蘇木精 1g
純酒精 50ml
冰醋酸 5 ml
甘油 50 ml
鉀礬（硫酸鋁鉀）約5g（飽和量）
蒸餾水 50 ml
ⅰ、將蘇木精溶於約15 ml的純酒精中，再加冰醋酸後攪拌。
ⅱ、當蘇木精溶解後即將甘油倒入並搖動容器，同時加入其餘的酒精。
ⅲ、將鉀礬在研缽中研碎並加熱，然後將它溶解於水中。
ⅳ、將溫熱的鉀礬溶液一滴一滴地加入上述染液中，並隨時攪動。
ⅴ、此液混合完畢，將瓶口用一層紗布包著小塊棉花塞起來，放在暗處通風的地方，並經常搖動以促進它的成熟。成熟時間約3~4周。若加入0.2g碘酸鈉，可立刻成熟。此液穩定而染色均勻，染核效果良好，不會發生沉澱，長期貯備無妨。此液可分別與伊紅等進行二重染色。
3、1%伊紅酒精溶液：
伊紅1g溶於100 ml95%酒精溶液。
4、1%鹽酸乙醇液
鹽酸 1份
70%酒精 100份
5、甘油蛋白貼片劑：
蛋白 50 ml
水楊酸鈉（防腐劑） 1g
配製時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫，然後用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經數小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。最後加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可儲存幾個月。
（三） 材料
鼠肝
三、實驗程式
1、 取材
頸椎脫臼法處死小鼠，開啟腹腔，剪取肝組織（或小腸）。切取的組織塊不宜太大，以便固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2~3mm厚。
取材的注意事項：
（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。
（2）切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇，儘可能不要損傷所需要的部分。
2、固定
將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，固定30~50min。
固定的注意事項：
（1）一般固定液，都以新配為好，配好後應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。
（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1~2次新液。
（4）材料固定完畢後，保存於嚴密緊塞或加蓋的容器裡，同時在容器外上標籤，並隨同材料在溶液中投入相應的標籤，以免相互混淆
黑墨水書寫。
1、 洗滌
材料經固定後，除乙醇外，組織中的固定液必須沖洗乾淨，尤其是含有重金屬的固定液。因為殘留在組織中的固定液，有的不利於染色，有的產生沉澱或結晶影響觀察。沖洗方法根據固定液的性質而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用50%~70%乙醇沖洗。
2、 脫水
30%、50%、70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水各40min，放入95%、100%各兩面三刀次，每次20min。各種材料經固定與洗滌後，組織中含有大量水分，由於水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。
脫水注意事項
（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。
（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內剩餘液，然後於皿中加入高一級脫水劑。
（3）在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。
（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。
（5）如需過夜，應停留在70%酒精中。
（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現白色混濁現象
5、透明
純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明為止），須換一次二甲苯。
由於乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶於乙醇又能溶於石蠟，所以脫水後還要經過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯佔有時，光線可以透過，組織呈現出不同程度的透明狀態。
透明注意事項
（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。
（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊乾涸，另一方面能避免吸收溼氣。
（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現白色霧狀，說明材料中的水未被脫淨，應退回純酒精中重新脫水，然後再透明。
6、透蠟
放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各20~30分鐘。
透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以
便包埋。透蠟時間根據組織的透蠟時間較長，約需1~2d。透蠟應在恆溫箱內進行，並保持箱內溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發脆。置於恆溫箱0.5h。
透蠟注意事項
（1）儘量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；
（2）透蠟溫度要恆定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，力求在最短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆
、收縮等。
1、 包埋
將經過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器內，然後立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊。
用於包埋的石蠟的熔點在50~60℃之間，包埋時應根據組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點的石蠟。一般動物材料常用的石蠟熔點為52~56℃，植物材料用的石蠟熔點為54~58℃。
包埋的操作過程
包埋時，將紙盒放在已經加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放於紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側的把手提起，慢慢地平放在面盆，並立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min）後即可取出備用。
2、 切片
①將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。
②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。
④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。
⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。
⑥一切調整好後主可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40~50r/min。
⑦切成的蠟帶到20~30cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免捲曲，並牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。
⑨切片工作結束後，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭乾淨妥為儲存。
3、 貼片
①、取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑於玻片中央，然後用洗淨的手指加以塗抹，便成
均勻薄層。
②、滴1~2滴的蒸餾水已塗粘片劑的載玻片上。
④、把玻片擺好片位置，在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展。或放置置於預先加熱的展片臺上（溫度保持在40~45℃）。此時蠟片因受熱而伸展攤平。並使之處於稍偏玻片的一端，另一端便於貼上標籤。
⑤、展片後把載玻片放在平盤上編好記號置於37℃溫箱烘乾，一晝夜乾燥後即可取出存放於切片盒待染。
10、脫蠟覆水
石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5~10min，然後放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各3~5min，再放
入蒸餾水中3min。
染色液多數為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。一般採用二甲苯脫蠟，逐級覆水與脫水浸蠟過程正好相
反，但是，由於蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。
11、染色
切片放入蘇木精中染色約10~30min。染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恆溫箱中染色。
12、水洗
用自來水流水沖洗約15min。沖洗過程中使切片顏色發藍（或放入鹼性水中也可，但用促藍劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應以流水沖洗使切片顯示藍色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，並隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。
13、分化
就是將細胞質著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數秒至數十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關鍵，，如分化不當會導致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，可取消此步驟。
14、漂洗
切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結構清楚；細胞質或結締組織纖維成分無色為標準。然後放入蒸餾水中漂洗一次。
15、脫水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。
16、復染
用0.5%伊紅乙醇液對比染色2~5min。伊紅主要染細胞質，著色濃淡應與蘇木精染細胞
核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質容易著色，並且經乙醇脫水時不易褪色。
17、脫水Ⅱ
放入95%乙醇中洗去多餘的紅色，然後放入無水乙醇中3~5min。最後用吸水紙吸乾多餘的乙醇。
18、透明
切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約5min，然後放入純二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯應儘量保持無水，應經常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。切片如在二甲苯中出現白霧現象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。
19、封藏：中性樹膠封存
切片經染色、脫水、透明後，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久儲存切片，便於鏡檢。常用的封藏劑一類為乾性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為溼性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是
接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用於短期儲存標本。
封藏的方法：
封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。材料透明後，按照下列方法進行封藏。在桌上放一張潔
淨的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯乾燥後再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然後再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在乾燥以後用刀颳去，並用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。
染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。
[實驗報告]
1、簡述石蠟切片的主要過程。
2、分析影響HE染色的主要因素。
石蠟切片法例項（二）
——番紅-固綠對染法
1、 熟悉植物石蠟切片的製作過程。
2、 掌握番紅-固綠對染法的基本原理和具體方法。
石蠟切片法也是在研究植物細胞的形態結構等方面常用的製片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成連續薄片，切片經染色，觀察效果甚好。番紅-固綠對染法，為
植物製片上最普遍的一種二重染色法，其染色程式簡單並能清晰地顯示出細胞的結構。番紅為鹼性染料，能使細胞核及木質化的細胞壁染成紅色；固綠為酸性染料，能使細胞質及纖維素的細胞壁染成綠色。
切片刀，切片機，溫箱，溫臺，解剖刀，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，蠟鏟，酒精燈，包埋紙盒，染色缸，玻片盤，溫度計，臉盆。
FAA固定液，1%番紅，1%固綠，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，石蠟，郝普特氏明膠粘片劑，樹膠。
試劑配法：
1、FAA固定液（福爾馬林-醋酸-灑精混合液）
福爾馬林 5 ml
50%或70%的灑 90 ml
此液適用於植物組織，此液中的酒精，有用50%的，也有用70%的，一般薄嫩的材料右用50%的，厚硬的材料用70%的，醋酸的用量也可根據材料情況作適當的改變，對一些大塊而密實的組織可增加用量，同時減少福爾馬林的用量。固定時間可因材料及醋酸含量的變化而異，一般為5~20h。固定的材料，一般無需用水洗，可直接從70%的酒精開始脫水。
1、 1%番紅
番紅1g溶於100ml水中。
2、 1%固綠
1g固綠溶於100ml95%酒精中。
3、 郝普特氏明膠粘片劑
明膠 1g
蒸餾水 100ml
石炭酸 2g
甘油 15ml
配製時先將明膠溶解於30
0℃的蒸餾水中（在水浴鍋內進行），待溶解後再加石炭酸和甘油，攪拌均勻後，趁熱過濾，貯存於玻璃瓶中。
大豆、小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆等。
取已培養好的大豆、小麥、蠶豆根或莖、葉等用刀
片將其尖端約1.2cm根尖切割下來，用刀
片切割其成熟區部分成5mm長的小段（亦可切帶側根的部分），將切好的材料放入玻管中。
2、 固定
將FAA固定液倒入盛有材料的玻管中，固定時間為24h。
3、 沖洗
用70%酒精換洗3次，每次0.5-2h。
4、 脫水
80%、90%酒精各1-2h，純酒精（中間換一次）1-2h。
5、 透明
等量純酒精及二甲苯中1-2h，二甲苯（中間換一次）1-2h。
6、 透蠟
方法同前。
7、 包埋
8、 切片
根為橫切面，其厚度為8~10um。
9、 貼片。
10、 番紅-固綠對染法染色程式如下：
（1）切片在二甲苯中脫蠟，約10min。
（2）等量純酒精二甲苯5min。
（3）經純酒精，95%、90%、80%、70%、505、305各級酒精各5min。
（4）蒸餾水2-5min。
（5）1%番紅水溶液染色2h左右。
（6）用水洗去多餘染液。
（7）50%、70%、80%、90%、95%各級酒精脫水10min。
（8）1%的固綠（用95%酒精配製）染色10-40s。
（9）95%酒精洗一下。
（10）純酒精脫水5min。
（11）等量純酒精二甲苯混合液中5min。
（12）二甲苯5min。
（13）中性樹膠封藏。
注意：
（1）番紅與固綠在酒精中很容易脫色，因此在酒精中脫水時，不能放置太久。
（2）用固綠對染之前應檢查番紅染色的是否合適，所染顏色應稍深一些，以防其在以後脫水步驟中仍會脫色，如果太淺，應退回重染。
石蠟切片
石蠟切片(固定切染色)步驟
VIP專享文件 2018-06-30 7頁
石蠟切片染色
1、 器材
切片刀，切片機，恆溫箱，溫臺，熔蠟爐，蠟杯，酒精燈，蠟鏟，展片臺，解剖刀，解剖針，解剖剪，解剖盤，培養皿，吸管，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤，樹膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計，臉盆，水浴鍋。
2、 試劑
卡諾氏固定液、FAA固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、埃利希蘇木精染液， 1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，郝普特氏粘片劑，中性樹膠。1%番紅，1%固綠，1%過碘酸，Schiff試劑，0.5%偏重亞硫酸鈉溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%~1%澱粉糖化酶溶液。
3、 材料
鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、莖、葉等。
4、 每個實驗小組的用量
(一)器材
切片機，切片刀，溫臺，恆溫箱，熔蠟爐，水浴鍋等這類幾個小組用一臺就行；解剖刀，單面刀片，小臺木，毛筆一隻，蠟鏟一個，蓋玻片和載玻片30個，臉盆一個，酒精燈各一個，包埋紙盒2~3個，染色缸一個，瓷杯3個，顯微鏡一臺。
（二）試劑
FAA固定液50ml、1%番紅100ml、1%固綠100ml、1%過碘酸100ml、Schiff試劑100ml、亞硫酸鹽300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%澱粉糖化酶溶液200ml，石蠟半盒、蜂蠟10塊、埃利希蘇木精染液100ml、1%伊紅酒精溶液100ml、1%鹽酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片劑數滴，中性樹膠數滴。
（三）材料
小白鼠一隻、蠶豆種，小麥和大豆種10~20粒，洋蔥和大蒜由實驗室統一種，然後取其所需部分。
石蠟切片法例項（一）
—蘇木精-伊紅對染法
一、目的要求
1、 熟悉石蠟切片的製作過程。
2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法。
二、實驗原理
石蠟切片是最基本的切片技術，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用範圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便於全面觀察組織構造，而且適用於各種固定液固定的材料，染色後不易褪色可長期儲存。經過HE染色，細胞核被蘇木素染成藍紫色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。
三、實驗用品
（一） 器材
切片機，切片刀，溫臺，恆溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小臺木，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。
（二） 試劑
卡諾（Carnoy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸乙醇液，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯
，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。
試劑
配法：
1、卡諾氏固定液：
100%酒精3份
冰醋酸 1份
或：100%酒精6份
氯仿 3份
冰醋酸 1份
2、埃利希蘇木精染液的配法：
蘇木精 1g
純酒精 50ml
冰醋酸 5 ml
甘油 50 ml
鉀礬（硫酸鋁鉀）約5g（飽和量）
蒸餾水 50 ml
配法：
ⅰ、將蘇木精溶於約15 ml的純酒精中，再加冰醋酸後攪拌。
ⅱ、當蘇木精溶解後即將甘油倒入並搖動容器，同時加入其餘的酒精。
ⅲ、將鉀礬在研缽中研碎並加熱，然後將它溶解於水中。
ⅳ、將溫熱的鉀礬溶液一滴一滴地加入上述染液中，並隨時攪動。
ⅴ、此液混合完畢，將瓶口用一層紗布包著小塊棉花塞起來，放在暗處通風的地方，並經常搖動以促進它的成熟。成熟時間約3~4周。若加入0.2g碘酸鈉，可立刻成熟。此液穩定而染色均勻，染核效果良好，不會發生沉澱，長期貯備無妨。此液可分別與伊紅等進行二重染色。
3、1%伊紅酒精溶液：
伊紅1g溶於100 ml95%酒精溶液。
4、1%鹽酸乙醇液
鹽酸 1份
70%酒精 100份
5、甘油蛋白貼片劑：
蛋白 50 ml
甘油 50 ml
水楊酸鈉（防腐劑） 1g
配製時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫，然後用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經數小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。最後加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可儲存幾個月。
（三） 材料
鼠肝
三、實驗程式
1、 取材
頸椎脫臼法處死小鼠，開啟腹腔，剪取肝組織（或小腸）。切取的組織塊不宜太大，以便固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2~3mm厚。
取材的注意事項：
（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。
（2）切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇，儘可能不要損傷所需要的部分。
2、固定
將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，固定30~50min。
固定的注意事項：
（1）一般固定液，都以新配為好，配好後應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。
（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1~2次新液。
（4）材料固定完畢後，保存於嚴密緊塞或加蓋的容器裡，同時在容器外上標籤，並隨同材料在溶液中投入相應的標籤，以免相互混淆
黑墨水書寫。
1、 洗滌
材料經固定後，除乙醇外，組織中的固定液必須沖洗乾淨，尤其是含有重金屬的固定液。因為殘留在組織中的固定液，有的不利於染色，有的產生沉澱或結晶影響觀察。沖洗方法根據固定液的性質而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用50%~70%乙醇沖洗。
2、 脫水
30%、50%、70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水各40min，放入95%、100%各兩面三刀次，每次20min。各種材料經固定與洗滌後，組織中含有大量水分，由於水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。
脫水注意事項
（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。
（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內剩餘液，然後於皿中加入高一級脫水劑。
（3）在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。
（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。
（5）如需過夜，應停留在70%酒精中。
（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現白色混濁現象
5、透明
純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明為止），須換一次二甲苯。
由於乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶於乙醇又能溶於石蠟，所以脫水後還要經過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯佔有時，光線可以透過，組織呈現出不同程度的透明狀態。
透明注意事項
（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。
（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊乾涸，另一方面能避免吸收溼氣。
（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現白色霧狀，說明材料中的水未被脫淨，應退回純酒精中重新脫水，然後再透明。
6、透蠟
放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各20~30分鐘。
透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以
便包埋。透蠟時間根據組織的透蠟時間較長，約需1~2d。透蠟應在恆溫箱內進行，並保持箱內溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發脆。置於恆溫箱0.5h。
透蠟注意事項
（1）儘量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；
（2）透蠟溫度要恆定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，力求在最短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆
、收縮等。
1、 包埋
將經過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器內，然後立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊。
用於包埋的石蠟的熔點在50~60℃之間，包埋時應根據組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點的石蠟。一般動物材料常用的石蠟熔點為52~56℃，植物材料用的石蠟熔點為54~58℃。
包埋的操作過程
包埋時，將紙盒放在已經加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放於紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側的把手提起，慢慢地平放在面盆，並立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min）後即可取出備用。
2、 切片
①將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。
②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。
④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。
⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。
⑥一切調整好後主可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40~50r/min。
⑦切成的蠟帶到20~30cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免捲曲，並牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。
⑨切片工作結束後，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭乾淨妥為儲存。
3、 貼片
①、取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑於玻片中央，然後用洗淨的手指加以塗抹，便成
均勻薄層。
②、滴1~2滴的蒸餾水已塗粘片劑的載玻片上。
④、把玻片擺好片位置，在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展。或放置置於預先加熱的展片臺上（溫度保持在40~45℃）。此時蠟片因受熱而伸展攤平。並使之處於稍偏玻片的一端，另一端便於貼上標籤。
⑤、展片後把載玻片放在平盤上編好記號置於37℃溫箱烘乾，一晝夜乾燥後即可取出存放於切片盒待染。
10、脫蠟覆水
石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5~10min，然後放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各3~5min，再放
入蒸餾水中3min。
染色液多數為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。一般採用二甲苯脫蠟，逐級覆水與脫水浸蠟過程正好相
反，但是，由於蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。
11、染色
切片放入蘇木精中染色約10~30min。染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恆溫箱中染色。
12、水洗
用自來水流水沖洗約15min。沖洗過程中使切片顏色發藍（或放入鹼性水中也可，但用促藍劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應以流水沖洗使切片顯示藍色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，並隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。
13、分化
就是將細胞質著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數秒至數十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關鍵，，如分化不當會導致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，可取消此步驟。
14、漂洗
切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結構清楚；細胞質或結締組織纖維成分無色為標準。然後放入蒸餾水中漂洗一次。
15、脫水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。
16、復染
用0.5%伊紅乙醇液對比染色2~5min。伊紅主要染細胞質，著色濃淡應與蘇木精染細胞
核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質容易著色，並且經乙醇脫水時不易褪色。
17、脫水Ⅱ
放入95%乙醇中洗去多餘的紅色，然後放入無水乙醇中3~5min。最後用吸水紙吸乾多餘的乙醇。
18、透明
切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約5min，然後放入純二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯應儘量保持無水，應經常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。切片如在二甲苯中出現白霧現象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。
19、封藏：中性樹膠封存
切片經染色、脫水、透明後，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久儲存切片，便於鏡檢。常用的封藏劑一類為乾性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為溼性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是
接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用於短期儲存標本。
封藏的方法：
封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。材料透明後，按照下列方法進行封藏。在桌上放一張潔
淨的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯乾燥後再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然後再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在乾燥以後用刀颳去，並用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。
染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。
[實驗報告]
1、簡述石蠟切片的主要過程。
2、分析影響HE染色的主要因素。
石蠟切片法例項（二）
——番紅-固綠對染法
一、目的要求
1、 熟悉植物石蠟切片的製作過程。
2、 掌握番紅-固綠對染法的基本原理和具體方法。
二、實驗原理
石蠟切片法也是在研究植物細胞的形態結構等方面常用的製片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成連續薄片，切片經染色，觀察效果甚好。番紅-固綠對染法，為
植物製片上最普遍的一種二重染色法，其染色程式簡單並能清晰地顯示出細胞的結構。番紅為鹼性染料，能使細胞核及木質化的細胞壁染成紅色；固綠為酸性染料，能使細胞質及纖維素的細胞壁染成綠色。
三、實驗用品
（一） 器材
切片刀，切片機，溫箱，溫臺，解剖刀，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，蠟鏟，酒精燈，包埋紙盒，染色缸，玻片盤，溫度計，臉盆。
（二）試劑
FAA固定液，1%番紅，1%固綠，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，石蠟，郝普特氏明膠粘片劑，樹膠。
試劑配法：
1、FAA固定液（福爾馬林-醋酸-灑精混合液）
福爾馬林 5 ml
50%或70%的灑 90 ml
冰醋酸 5 ml
此液適用於植物組織，此液中的酒精，有用50%的，也有用70%的，一般薄嫩的材料右用50%的，厚硬的材料用70%的，醋酸的用量也可根據材料情況作適當的改變，對一些大塊而密實的組織可增加用量，同時減少福爾馬林的用量。固定時間可因材料及醋酸含量的變化而異，一般為5~20h。固定的材料，一般無需用水洗，可直接從70%的酒精開始脫水。
1、 1%番紅
番紅1g溶於100ml水中。
2、 1%固綠
1g固綠溶於100ml95%酒精中。
3、 郝普特氏明膠粘片劑
明膠 1g
蒸餾水 100ml
石炭酸 2g
甘油 15ml
配製時先將明膠溶解於30
0℃的蒸餾水中（在水浴鍋內進行），待溶解後再加石炭酸和甘油，攪拌均勻後，趁熱過濾，貯存於玻璃瓶中。
（三）材料
大豆、小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆等。
三、實驗程式
1、 取材
取已培養好的大豆、小麥、蠶豆根或莖、葉等用刀
片將其尖端約1.2cm根尖切割下來，用刀
片切割其成熟區部分成5mm長的小段（亦可切帶側根的部分），將切好的材料放入玻管中。
2、 固定
將FAA固定液倒入盛有材料的玻管中，固定時間為24h。
3、 沖洗
用70%酒精換洗3次，每次0.5-2h。
4、 脫水
80%、90%酒精各1-2h，純酒精（中間換一次）1-2h。
5、 透明
等量純酒精及二甲苯中1-2h，二甲苯（中間換一次）1-2h。
6、 透蠟
方法同前。
7、 包埋
方法同前。
8、 切片
根為橫切面，其厚度為8~10um。
9、 貼片。
方法同前。
10、 番紅-固綠對染法染色程式如下：
（1）切片在二甲苯中脫蠟，約10min。
（2）等量純酒精二甲苯5min。
（3）經純酒精，95%、90%、80%、70%、505、305各級酒精各5min。
（4）蒸餾水2-5min。
（5）1%番紅水溶液染色2h左右。
（6）用水洗去多餘染液。
（7）50%、70%、80%、90%、95%各級酒精脫水10min。
（8）1%的固綠（用95%酒精配製）染色10-40s。
（9）95%酒精洗一下。
（10）純酒精脫水5min。
（11）等量純酒精二甲苯混合液中5min。
（12）二甲苯5min。
（13）中性樹膠封藏。
注意：
（1）番紅與固綠在酒精中很容易脫色，因此在酒精中脫水時，不能放置太久。
（2）用固綠對染之前應檢查番紅染色的是否合適，所染顏色應稍深一些，以防其在以後脫水步驟中仍會脫色，如果太淺，應退回重染。