內切酶主要分成三大類。
第一類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中沒有多大用處，無法用於分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。
第二類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由於這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，並能構建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、9個、10個和11個核苷酸的。如果識別位置在DNA分子中分佈是隨機的，則識別4個核苷酸的限制性內切酶每隔46（4096）個核苷酸就有一個切點。人的單倍體基因組據估計為3×199核苷酸，識別4個核苷酸的限制性內切酶的切點將有（3×109/2.5×102）約107個切點，也就是可被這種酶切成107片段，識別6個核苷酸的限制性內切酶也將有（3×109/4×103）約106個切點。
第二類內切酶的識別順序是一個迴文對稱順序，即有一箇中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為：
↓ |
5’……GAA | TTC……3’
3’……CTT | AAG……5’
| ↑
垂直虛線表示中心對稱軸，從兩側“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是迴文順序（palindrome）。實線剪頭表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割後生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，可透過形成氫鍵而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如HaeⅢ的識別位置是：
↓
5’……GG↓CC……3’
3’……CC↓GG……’
↑
在箭頭所指處切割，產生的兩個DNA片段是：
5’……GG CC……3’
和
3’……CC GG……5’
有時候兩種限制性內切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在於當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer）。
第三類內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的迴文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此，這種限制性內切酶切割後產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對於克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。
內切酶主要分成三大類。
第一類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中沒有多大用處，無法用於分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。
第二類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由於這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，並能構建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、9個、10個和11個核苷酸的。如果識別位置在DNA分子中分佈是隨機的，則識別4個核苷酸的限制性內切酶每隔46（4096）個核苷酸就有一個切點。人的單倍體基因組據估計為3×199核苷酸，識別4個核苷酸的限制性內切酶的切點將有（3×109/2.5×102）約107個切點，也就是可被這種酶切成107片段，識別6個核苷酸的限制性內切酶也將有（3×109/4×103）約106個切點。
第二類內切酶的識別順序是一個迴文對稱順序，即有一箇中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為：
↓ |
5’……GAA | TTC……3’
3’……CTT | AAG……5’
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垂直虛線表示中心對稱軸，從兩側“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是迴文順序（palindrome）。實線剪頭表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割後生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，可透過形成氫鍵而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如HaeⅢ的識別位置是：
↓
5’……GG↓CC……3’
3’……CC↓GG……’
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在箭頭所指處切割，產生的兩個DNA片段是：
5’……GG CC……3’
和
3’……CC GG……5’
有時候兩種限制性內切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在於當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer）。
第三類內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的迴文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此，這種限制性內切酶切割後產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對於克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。