轉化:目的基因插入Ti質粒的T-DNA上——進入農桿菌——匯入植物細胞——目的基因整合到植物染色體的DNA上——目的基因得以穩定維持和表達
1、獲取目的基因:用限制性核酸內切酶切割下目的基因。
2、基因表達載體的構建:將目的基因與載體(大多數選用質粒)用DNA連線酶連線起來。
3、將目的基因匯入受體細胞:將含目的基因的重組質粒匯入農桿菌(農桿菌為受體細胞)。
4、目的基因的檢測與鑑定:用DNA分子雜交技術/分子雜交技術/抗原-抗體雜交/個體生物學水平鑑定(這個方法需要匯入重組後的細胞的植物體,詳見第五步) 幾種方法進行檢驗(根據要求選取不同方法)。
5、最後將成功表達的細胞匯入植物體內,對植物體進行個體生物學水平鑑定。
整個轉基因體系的建立步驟大致可以歸納為:目的載體的構建---載體的農桿菌轉化---農桿菌與植株共培養---轉化植株的篩選---轉化植株的鑑定。
在每一步中都涉及到很多的方法與技術。目的載體的構建,包括目的基因的克隆、載體的酶切、連線(用限制性核酸內切酶與DNA連線酶),以及測序分析。載體的農桿菌轉化,目前有很成熟的方法,試驗中應注意熱激和冷激的時間。農桿菌與植株的共培養,即為植株轉化實驗,在溶液中加入促進植株愈傷生長的激素能一定程度提高轉化率。轉化植株的篩選,大多是利用抗生素進行篩選的,抗生素的選擇則需根據目的載體確定,設定不同梯度的抗生素對植株進行篩選。轉化植株的鑑定,一般採用PCR法。以上所有的操作,都應該在無菌環境下進行,無菌是植物組培的一項基本,但是重要的要素。
轉化:目的基因插入Ti質粒的T-DNA上——進入農桿菌——匯入植物細胞——目的基因整合到植物染色體的DNA上——目的基因得以穩定維持和表達
1、獲取目的基因:用限制性核酸內切酶切割下目的基因。
2、基因表達載體的構建:將目的基因與載體(大多數選用質粒)用DNA連線酶連線起來。
3、將目的基因匯入受體細胞:將含目的基因的重組質粒匯入農桿菌(農桿菌為受體細胞)。
4、目的基因的檢測與鑑定:用DNA分子雜交技術/分子雜交技術/抗原-抗體雜交/個體生物學水平鑑定(這個方法需要匯入重組後的細胞的植物體,詳見第五步) 幾種方法進行檢驗(根據要求選取不同方法)。
5、最後將成功表達的細胞匯入植物體內,對植物體進行個體生物學水平鑑定。
整個轉基因體系的建立步驟大致可以歸納為:目的載體的構建---載體的農桿菌轉化---農桿菌與植株共培養---轉化植株的篩選---轉化植株的鑑定。
在每一步中都涉及到很多的方法與技術。目的載體的構建,包括目的基因的克隆、載體的酶切、連線(用限制性核酸內切酶與DNA連線酶),以及測序分析。載體的農桿菌轉化,目前有很成熟的方法,試驗中應注意熱激和冷激的時間。農桿菌與植株的共培養,即為植株轉化實驗,在溶液中加入促進植株愈傷生長的激素能一定程度提高轉化率。轉化植株的篩選,大多是利用抗生素進行篩選的,抗生素的選擇則需根據目的載體確定,設定不同梯度的抗生素對植株進行篩選。轉化植株的鑑定,一般採用PCR法。以上所有的操作,都應該在無菌環境下進行,無菌是植物組培的一項基本,但是重要的要素。