1、問:用免疫熒光方法做組織切片和培養細胞內的蛋白，兩者操作過程有哪些不同?
參考見解:只是固定方法不同。細胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。
2、問:近期要做免疫熒光雙標，不知哪位有免疫熒光雙標技術的詳細步驟及其注意事項?
參考見解:我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經驗是:
(2)我的做法是兩種一抗（CHI抗體）同時孵育，然後兩種二抗同時孵育。抗體濃度、孵育時間要仔細摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。
(3)我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒游標記物對照是PBS+熒游標記物。
(5)其餘步驟同一般免疫熒光單標操作。
3、問:本人擬做Brdu標記神經幹細胞免疫熒光，二抗為FITC標記，想請教各位大俠:
(1)抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時是否一定要在暗室中進行?
(2)封片時是否用甘油緩衝液即可，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%過氧化氫及2N鹽酸是否還需要用?
參考見解:
(1)你的二抗是用FITC標記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液，後者能使玻片透明;
(3)關於免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%H2O2以去除內源性過氧化物酶;2N鹽酸需要使用，目的是使DNA變性，讓Brdu抗體能夠充分地與已經摻入的Brdu結合。
4、問:做間接法免疫熒光染色，如何設定對照?
參考見解:最好是同一視野在未用熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
(1)空白對照:如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自發熒光，脫蠟後直接在熒光顯微鏡下觀察。
(2)陰性對照:標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
(3)抗原對照:標本加同種動物的未免疫血清，以PBS沖洗後，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
5、問:我做乳腺組織的免疫熒光染色，結果用鐳射共聚焦顯微鏡看很好:有陽性訊號，陰性對照組也沒有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個結果才是真實的呢?
參考見解:鐳射共聚焦顯微鏡的解析度比普通熒光顯微鏡要高的多，出現上述現象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結果為主。
1、問:用免疫熒光方法做組織切片和培養細胞內的蛋白，兩者操作過程有哪些不同?
參考見解:只是固定方法不同。細胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。
2、問:近期要做免疫熒光雙標，不知哪位有免疫熒光雙標技術的詳細步驟及其注意事項?
參考見解:我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經驗是:
(2)我的做法是兩種一抗（CHI抗體）同時孵育，然後兩種二抗同時孵育。抗體濃度、孵育時間要仔細摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。
(3)我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒游標記物對照是PBS+熒游標記物。
(5)其餘步驟同一般免疫熒光單標操作。
3、問:本人擬做Brdu標記神經幹細胞免疫熒光，二抗為FITC標記，想請教各位大俠:
(1)抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時是否一定要在暗室中進行?
(2)封片時是否用甘油緩衝液即可，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%過氧化氫及2N鹽酸是否還需要用?
參考見解:
(1)你的二抗是用FITC標記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液，後者能使玻片透明;
(3)關於免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%H2O2以去除內源性過氧化物酶;2N鹽酸需要使用，目的是使DNA變性，讓Brdu抗體能夠充分地與已經摻入的Brdu結合。
4、問:做間接法免疫熒光染色，如何設定對照?
參考見解:最好是同一視野在未用熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
(1)空白對照:如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自發熒光，脫蠟後直接在熒光顯微鏡下觀察。
(2)陰性對照:標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
(3)抗原對照:標本加同種動物的未免疫血清，以PBS沖洗後，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
5、問:我做乳腺組織的免疫熒光染色，結果用鐳射共聚焦顯微鏡看很好:有陽性訊號，陰性對照組也沒有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個結果才是真實的呢?
參考見解:鐳射共聚焦顯微鏡的解析度比普通熒光顯微鏡要高的多，出現上述現象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結果為主。