逆轉錄酶(reversetranscriptase)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年很多研究者從一些致癌RNA病毒中發現這種酶，該酶催化以單鏈RNA為模板生成雙鏈DNA的反應。由於這一反應中的遺傳資訊的流動方向正好與絕大多數生物轉錄生成方向(即DNA模板轉錄生成RNA的方向)相反，所以此反應稱為逆轉錄作用。逆轉錄酶具有三種酶活性：①RNA指導的DNA合成反應；②DNA指導的DNA合成的反應；③RNA的水解的反應。 基因工程中有兩種商品化的逆轉錄酶：一種來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(avianmyoblastosisvirus,AMV)提取的；另一種是Moloney鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus,Mo-MLV)克隆的逆轉錄酶編碼基因在大腸桿菌的表達產物。這兩種逆轉錄酶有一些區別，禽源逆轉錄酸在42℃(雞的正常體溫)能有效發揮作用，而鼠源逆轉錄酶在42℃時則迅速失活。禽源逆轉錄酶能更有效地複製較複雜的mRNA。禽源逆轉錄酶和鼠源逆轉錄酶均屬多功能酶，它們的共同性質是：①具有RNA指導的DNA聚合酶活性，可以RNA為模板，以寡聚脫氧核糖核苷酸為引物，合成互補的DNA(cDNA)；②具有DNA指導的DNA聚合酶活性，但不具DNA聚合酶那樣的3′→5′外切酶活性；③具有RNaseH活性，即從5′或3端連續地降解RNA：DNA雜種雙鏈中的RNA部分。 在基因工程中，逆轉錄酶的主要用途是：①將真核基因的mRNA轉錄成cDNA，構建cDNA文庫，進行克隆實驗；②對具有5′突出端的DNA片段的3′端進行填補(補平反應)和標記，製備探針；③代替Klenow大片段，用於DNA序列測定。