1、與酶蛋白結合緊密程度不同2、分離方法不同經透析或超濾方法可使輔酶與酶蛋白分離；而輔基與酶蛋白結合緊密，不能透過透析或超濾方法除去。3、遊離性不同輔酶可以以不與酶結合的形式存在，並可結合成為多種酶的輔酶，它的遊離特性在功能上保證了輔酶的運載能力。在酶促反應中，輔酶作為底物接受質子或基團後離開酶蛋白，參與另一酶促反應並將其所攜帶的質子或基團轉移出去，或者相反。在酶促反應中，輔基不能離開酶蛋白。酶失去了輔基就無法實現功能，失去了活性；而離開了酶輔基也無法單獨存在。

1、與酶蛋白結合緊密程度不同

輔酶和輔基的主要區別在於與酶蛋白結合的緊密程度不同，非蛋白質部分與酶蛋白結合鬆散稱為輔酶，非蛋白質部分與酶蛋白結合牢固的稱為輔基。

2、分離方法不同

經透析或超濾方法可使輔酶與酶蛋白分離；而輔基與酶蛋白結合緊密，不能透過透析或超濾方法除去。

3、遊離性不同

輔酶可以以不與酶結合的形式存在，並可結合成為多種酶的輔酶，它的遊離特性在功能上保證了輔酶的運載能力。在酶促反應中，輔酶作為底物接受質子或基團後離開酶蛋白，參與另一酶促反應並將其所攜帶的質子或基團轉移出去，或者相反。

在酶促反應中，輔基不能離開酶蛋白。酶失去了輔基就無法實現功能，失去了活性；而離開了酶輔基也無法單獨存在。