醬油用的原料是植物性蛋白質和澱粉質。植物性蛋白質遍取自大豆榨油後的豆餅，或溶劑浸出油脂後的豆粕，也有以花生餅、蠶豆代用，傳統生產中以大豆為主；澱粉質原料普遍採用小麥及麩皮，也有以碎米和玉米代用，傳統生產中以麵粉為主。原料經蒸熟冷卻，接入純粹培養的米麴黴菌種製成醬曲，醬曲移入發酵池，加鹽水發酵，待醬醅成熟後，以浸出法提取醬油。

制曲的目的是使米麴黴在曲料上充分生長髮育，並大量產生和積蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、澱粉酶、谷氨醯胺酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。在發酵過程中味的形成是利用這些酶的作用。如蛋白酶及肽酶將蛋白質水解為氨基酸，產生鮮味；谷氨醯胺酶把萬分中無味的谷氨醯胺變成具有鮮味的俗穀氨酸；澱粉酶將澱份水解成糖，產生甜味；果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等能將細胞壁完全破裂，使蛋白酶和澱粉酶水解等更徹底。

同時，在制曲及發酵過程中，從空氣中落入的酵母和細菌也進行繁殖並分泌多種酶。也可新增純粹培養的乳酸菌和酵母菌。由乳酸菌產生適量乳酸，由酵母菌發酵生產乙醇，以及由原料成分、麴黴的代謝產物等所生產的醇、酸、醛、酯、酚、縮醛和呋喃酮等多種成分，雖多屬微量，但卻能構成醬油複雜的香氣。

此外，由原料蛋白質中的酪氨酸經氧化生成黑色素及澱份經典黴澱粉酶水解為葡萄糖與氨基酸反應生成類黑素，使醬油產生鮮豔有光澤的紅褐色。發酵期間的一系列極其複雜的生物化學變化所產生的鮮味、甜味、酸味、酒香、酯香與鹽水的鹹味相混和，最後形成色香味和風味獨特的醬油。