原理：利用PCR高度的特異性，透過特定的引物能在複雜樣品中得到的特定序列的DNA，而這種特定DNA的產量跟反應初始階段模板量是直接相關的。簡單說來。經過一個PCR迴圈，可以把一個模板變成兩個，在經過一個迴圈，就會變成四個，以此類推。如果PCR的檢測線是1000個產物，那麼當你的初始樣品中模板是n個，那就需要經歷的迴圈數為 的時候才能檢測，這就把迴圈數與初始樣品中模板數聯絡起來了。也就是說經過計算，達到檢測限的迴圈數就能反映初始RNA樣品中某種RNA的含量多少。 在實際中，使用了特殊的含有熒光劑的引物，光學檢測相應光強度的產物所需的迴圈數，能高度靈敏的達到目的。 realtime-PCR有兩種。絕對定量和相對定量。 絕對定量常用於逆轉錄病毒侵染細胞的檢測。用途：透過逆轉錄，以及taq酶利用HIV的特異引物進行擴增，最終的迴圈數可以反應你的這群T細胞正在被多少個HIV侵染。 相對定量常用於檢測實時的轉錄譜。

1.逆轉錄PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉錄PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板透過PCR進行DNA擴增。2.雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性溫度過低或變性時間過短，會使僅僅富含A+T區域變性。當模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性溫度。3.復性過程採用的溫度至關重要如果復性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復性，擴增效率將會降低。如果復性溫度太低，引物將產生非特異性復性，從而導致非特異性的DNA片段的擴增。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進行。4.PCR擴增所需的迴圈數目決定於反應體系中起始的模板複製數以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應進入幾何級數的增長期，反應會一直持續下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點上來說，擴增產物中絕大多數應該是特異性的擴增產物，而非特異性的擴增產物應該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個含有10的5次方個複製的靶序列的反應體系中進行30個迴圈後往往可以做到上述的理想情況。