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  • 1 # toogr10720

    TRIzol使樣品勻漿化,細胞裂解,溶解細胞內含物,同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心後,溶液分為水相和有機相,RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉澱可回收RNA;用乙醇沉澱中間層可回收DNA;用異丙醇沉澱有機相可回收蛋白質。

  • 2 # 掉眼淚的冠軍

    實驗步驟:1. 提取組織RNA時,每50~100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解:提取細胞RNA時,先離心沉澱細胞,每5~106個細胞加1ml Trizol後,反覆用槍吹打或劇烈震盪以裂解細胞;2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在試問15~30℃下放置5分鐘;3. 在上述EP管中,按照每1mlTrizol後加0.2ml氯仿的量加入氯仿,蓋上EP管蓋子,在手中用力震盪15秒,在室溫下(15~30℃)放置2~3分鐘後,12000g(2~8℃)離心15分鐘;4. 去上層水相置於新EP管中,按照每1mlTrizol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇,在室溫下(15~30℃)放置10分鐘後,12000g(2~8℃)離心10分鐘;5. 棄上清,按照每1ml Trizol加1ml75% 乙醇進行洗滌,渦旋混合,7500g(2~8℃)離心5分鐘,棄上清;6. 讓沉澱的RNA在室溫在自然乾燥;7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉澱各試劑的作用:1、 TRIZOL主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞,使細胞中的蛋白,核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase(RNA酶)。TRIZOL是從細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑,在樣品裂解或勻漿過程中,TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿後,溶液分為水相和有機相,RNA在水相中。取出水相,用異丙醇可沉澱回收RNA。※0.1%的8-羥基喹啉可以抑制RNase,與氯仿聯合使用可增強抑制作用。※異硫氰酸胍屬於解偶劑,是一類強力的蛋白質變性劑,可溶解蛋白質並使蛋白質二級結構消失,導致細胞結構降解,核蛋白迅速與核酸分離。※β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。 2、 氯仿為有機溶劑與水互不相溶,RNA(核糖核“酸”的鹽型)是離子化合物,溶於水相 3、異丙醇能與與任意比例的水混合,因此加入異丙醇,能夠奪取RNA/DNA周圍的水分,RNA/DNA能夠聚集而發生沉澱。

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