1．底物濃度 除選擇適合的底物外，在實際應用中更多考慮的是底物濃度。由於[S]與反應速度V成雙曲線關係，在酶活性測定時，要求[S]達到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。2．酶濃度 在反應條件一定時，酶濃度與反應速度成正比。按照中間產物學說，只有[S]>>[E]時，酶才能被底物分子飽和，反應速度才能達到最大值。因此當標本酶活力過高時，應將標本適當稀釋後再加以測定。3．溫度 不同的酶最適溫度可以不同，多數酶的最適溫度在37～40℃。高於或低於最適溫度,酶活性都降低。4．離子強度和pH值 在最適pH時，酶的活性最強，高於或低於最適pH，酶的活性都降低。5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類輔酶是結合酶的輔助因子。這些酶離開它們的輔基或輔酶就不能表現活性，因此在酶活性測定時，就要保證輔基或輔酶的供給。6．啟用劑 有些酶在有啟用劑存在時才有活性或活性較高。因此在酶活性測定時也，要滿足酶對啟用劑的需要。7．抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制，後者又可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。重金屬離子和砷化物對巰基酶的抑制、有機磷對羥基酶的抑制屬於不可逆抑制；丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的抑制屬於競爭性抑制；哇巴因對Na+，K+-ATP酶的抑制屬於非競爭性抑制.抑制劑使酶活性降低,在測定酶活性時，應避免抑制劑的影響。

測定酶活性濃度的方法的原理：

透過測定酶反應開始後某一時間段內（t1到t2）產物或底物濃度的總變化量來求取酶反應初速度，其中t1往往取反應開始的時間。在酶反應一定時間後，往往透過加入強酸、強鹼、蛋白沉澱劑等，使反應完全停止，所以叫做中止反應法。

注意：必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要很精確，否則會引起較大誤差。