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  • 1 # 使用者8461021162376

    TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)把PCR片斷與一個具有3‘-T突出的載體DNA連線起來的方法。因為PCR反應中所使用的聚合酶具有末端轉移的活性,通常在3"加上A。

    例如:Taq聚合酶同時具有的末端連線酶的功能,PCR反應時在每條PCR擴增產物的3`端自動新增一個3`-A突出端。只有用經過特殊處理的具有3’-T突出末端的DNA片斷才能透過T/A配對進行連線。

     透過PCR的方法擴增目的基因片斷的過程中,由於往往不清楚目的基因的DNA序列,獲得的目的片斷通常需要透過TA克隆的方法,重組到T-載體中,透過序列測定清楚DNA序列。由於在PCR過程中,使用的DNA聚合酶不同,往往分為2種情況:

    (1)使用不同的Taq酶,在PCR擴增迴圈結束後,加上72℃ 10分鐘一個過程,Taq酶可以在擴增產物的3末端加上A,因此PCR產物回收純化後可以和T載體直接連線。

    (2)使用高保真的DNA聚合酶,如pfu酶,由於其不能在擴增產物的3末端加上A,得到的DNA序列為鈍端,因此,需要在回收純化後進行加A的過程,通常是以PCR回收產物為模板,加上一定量的普通Taq酶和反應液,加入dATP(或dNTP), 72℃ 10分鐘,然後將加A產物直接用於TA連線。

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