1、細胞接種密度

一般情況下，96孔培養板的一孔內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由於不同細胞貼壁後大小差異懸殊，因此，在進行MTT試驗前，有必要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止時細胞不過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成量與細胞數呈線性關係。如果細胞數過多則敏感性降低，而太少則觀察不到差異。

2、藥物濃度的設定

設定加藥濃度前一定要多看文獻，參考別人的結果先確定一個比較大的範圍初篩，再根據自己初篩的結果縮小濃度和時間範圍細篩。切不可憑空想象個濃度區間，這樣很可能你用濃度根本不是藥物的有效濃度。如果沒有相關方面的文獻報道，初篩時一定要保證濃度範圍足夠大，並逐漸縮小範圍，找到最適濃度區間。

3、時間點的設定

在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最後得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什麼時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。

4、培養時間

200μl的培養液對於104～105個增殖期細胞來說，很難維持48h以上，而營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而靜止，對實驗結果影響很大，建議實驗超過48h以上的，在培養48h時進行換液。［對於某些需要長時間作用且易降解的藥物，應在培養24h時以含相應的藥物濃度培養液進行換液處理］

5、試驗敏感性

MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，儘量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。

6、實驗時應設定調零孔/對照孔/加藥孔

調零孔(空白對照)加培養基、MTT、二甲基亞碸。對照孔(溶媒對照)和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。