謝邀。高保真的酶是不能夠用來PCR後直接去連線TA克隆的，必須用TAQ加A尾純化後才能連線.給你個做的方法，首先PCR擴增目的片段，可以配兩個40ul的體系，PCR迴圈可以增加到35個迴圈，這樣可以保證PCR產物量多，而且保真性也好。然後跑膠，膠回收，膠回收溶解DNA的時候，儘量用比較大的體積的水溶解下來，這樣可以保證儘可能量大的獲得PCR產物，然後去加A尾，加A尾的時候，使用ATP和dATP都可以，但是ATP跟dATP不可濃度太高，太高濃度的dATP會抑制taq酶的活性，taq酶加的時候要控制在總體積的百分之十以內，加A尾一般是72度，30min.l,自己做的時候可以適當延長時間。加A尾完成後，膠回收，儘量用少的水來溶解DNA,這個時候要保證DNA的濃度儘可能的高。連線的時候，如果片段濃度高的話，片段又不太長，我習慣連1h,轉化挑克隆基本效率能有百分之百，如果片段濃度低，長度又長，可以適當延長連線時間。TA克隆載體大小相對來小，裝載片段的長度是有限的，片段長度如果比載體還大，效率就會降低，這時候儘量要多PCR,延長連線時間，這樣子可以提高效率的。再補一段，鑑定的時候可以先把細菌挑到96孔板，細菌搖起來以後去PCR鑑定，Takara 的PMD19T裡應該有說明書的，裡面應該有設計好的引物。
謝邀。高保真的酶是不能夠用來PCR後直接去連線TA克隆的，必須用TAQ加A尾純化後才能連線.給你個做的方法，首先PCR擴增目的片段，可以配兩個40ul的體系，PCR迴圈可以增加到35個迴圈，這樣可以保證PCR產物量多，而且保真性也好。然後跑膠，膠回收，膠回收溶解DNA的時候，儘量用比較大的體積的水溶解下來，這樣可以保證儘可能量大的獲得PCR產物，然後去加A尾，加A尾的時候，使用ATP和dATP都可以，但是ATP跟dATP不可濃度太高，太高濃度的dATP會抑制taq酶的活性，taq酶加的時候要控制在總體積的百分之十以內，加A尾一般是72度，30min.l,自己做的時候可以適當延長時間。加A尾完成後，膠回收，儘量用少的水來溶解DNA,這個時候要保證DNA的濃度儘可能的高。連線的時候，如果片段濃度高的話，片段又不太長，我習慣連1h,轉化挑克隆基本效率能有百分之百，如果片段濃度低，長度又長，可以適當延長連線時間。TA克隆載體大小相對來小，裝載片段的長度是有限的，片段長度如果比載體還大，效率就會降低，這時候儘量要多PCR,延長連線時間，這樣子可以提高效率的。再補一段，鑑定的時候可以先把細菌挑到96孔板，細菌搖起來以後去PCR鑑定，Takara 的PMD19T裡應該有說明書的，裡面應該有設計好的引物。