做RNA的瓊脂糖凝膠電泳具體操作和步驟如下: 1.去離子甲醯胺。v電泳槽清洗:去汙劑洗乾淨(一般浸泡過夜)水沖洗乙醇乾燥-3%H2O2灌滿室 溫放置10分鐘0.1%DEPC水沖洗
2.將制膠用具用70%乙醇中洗一遍,晾乾備用
3.配製晾脂糖凝膠。
稱0.5g瓊脂糖,置乾淨的100ml錐形瓶中, 加入40ml蒸餾水,微波爐內加熱使稱脂糖徹底溶化均勻。
待膠涼至60-70 ℃,依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10x MOPS緩衝液和0.5μl溴化乙錠,混合均勻。
灌製瓊脂糖凝膠。
4.取DEPC處理過的500μl小離心管,依次加入如下試劑:10x MOPS愛衝液2μl,甲醛3.5μl,甲醯胺(去離子) 10μl, RNA樣品4.5μl,混勻;上樣;電泳:電泳槽內加入1XMOPS緩衝液,於7.5V/ml 的電壓下電泳;電泳結束後,在紫外燈下檢查結果。
擴充套件資料
瓊脂糖凝膠電泳的分析原理與其他支援物電泳最主要區別是:它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。
瓊脂糖凝膠具有網路結構,物質分子透過時會受到阻力,大分子物質在湧動時受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決於淨電荷的性質和數量,而且還取決於分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由於其孔徑相比於蛋白質太大,對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道,現廣泛應用於核酸的研究中。
蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷,在電場中受力大小不同,因此跑的速度不同,根據這個原理可將其分開。電泳緩衝液的pH在6~9之間,離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支援物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段,其解析度雖比聚丙烯醯胺凝膠低,但它製備容易,分離範圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的範圍為0.2-20kb,利用脈衝電泳,可分離高達10^7bp的DNA片段。
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。由於糖-磷酸骨架在結構上的重複性質,相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的淨電荷,因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。
做RNA的瓊脂糖凝膠電泳具體操作和步驟如下: 1.去離子甲醯胺。v電泳槽清洗:去汙劑洗乾淨(一般浸泡過夜)水沖洗乙醇乾燥-3%H2O2灌滿室 溫放置10分鐘0.1%DEPC水沖洗
2.將制膠用具用70%乙醇中洗一遍,晾乾備用
3.配製晾脂糖凝膠。
稱0.5g瓊脂糖,置乾淨的100ml錐形瓶中, 加入40ml蒸餾水,微波爐內加熱使稱脂糖徹底溶化均勻。
待膠涼至60-70 ℃,依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10x MOPS緩衝液和0.5μl溴化乙錠,混合均勻。
灌製瓊脂糖凝膠。
4.取DEPC處理過的500μl小離心管,依次加入如下試劑:10x MOPS愛衝液2μl,甲醛3.5μl,甲醯胺(去離子) 10μl, RNA樣品4.5μl,混勻;上樣;電泳:電泳槽內加入1XMOPS緩衝液,於7.5V/ml 的電壓下電泳;電泳結束後,在紫外燈下檢查結果。
擴充套件資料
瓊脂糖凝膠電泳的分析原理與其他支援物電泳最主要區別是:它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。
瓊脂糖凝膠具有網路結構,物質分子透過時會受到阻力,大分子物質在湧動時受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決於淨電荷的性質和數量,而且還取決於分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由於其孔徑相比於蛋白質太大,對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道,現廣泛應用於核酸的研究中。
蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷,在電場中受力大小不同,因此跑的速度不同,根據這個原理可將其分開。電泳緩衝液的pH在6~9之間,離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支援物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段,其解析度雖比聚丙烯醯胺凝膠低,但它製備容易,分離範圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的範圍為0.2-20kb,利用脈衝電泳,可分離高達10^7bp的DNA片段。
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。由於糖-磷酸骨架在結構上的重複性質,相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的淨電荷,因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。