你是做什麼物種.如果是已經測序全基因組的物種,找這兩個標記在染色體上的位置,然後下載其間的序列,一段一段做blast,找同源物種（或亞種）之間有indel的區段設計引物,包含indel在裡面,長度為90-200bp之間都可以,我一般用110bp左右.如果初步定位區段比較大,可以隔500kb一個標記先再確定一下.如果是做大群體定的話,那就卡在兩端了,關鍵是找到好用的引物.

如何設計引物，擴增目的基因的ORF

無論您是先提RNA再做反轉錄,還是直接從DNA中獲得基因,考慮到模板的複雜性,都應當使用巢式PCR.建議您先從目的基因的上下游設計一段引物,即外引物,再根據目的基因上下游設計一段內引物.

外引物不在目的基因上,可以在目的基因上下游100bp以內,這就可以利用引物設計軟體找出最優秀的引物,提高了第一次PCR的成功率.將第一次PCR產物做模板,進行第二次PCR,這樣如果P出了大小正確的條帶,就可以肯定是你的目的條帶.因為兩次特異性擴增再加上大小正確,這樣的總特異性是極高的.

另外,由於在第二次PCR過程中,模板是第一次PCR產物,成分單一,就是內引物再糟糕,也沒有問題,這就規避了你提到的“那如果在CDS區兩端設計不出引物怎麼辦?”這個問題.