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  • 1 # 使用者1883606840346

    基因功能的研究思路主要包括:

    1.基因的亞細胞定位和時空(發育期或梯度藥物處理濃度, 不同組織/器官)表達譜;

    2.基因在轉錄水平的調控(可以透過genome walking PCR或透過已有的資源庫尋找該基因的啟動子等轉錄調控區域, 透過單雜交或ChIP等技術, 尋找該基因的轉錄調控蛋白)3.細胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用複合體的尋找驗證,具體方法有酵母雙雜交, GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,對該基因的表達產物做一個細胞訊號轉導通路的定位)4.gain-of-function & loss-of-function: 也就是分別在細胞和個體水平,做該基因的超表達和knockdown(或knockout), 從表型分析該基因的功能.功能研究應從完整的分子-細胞-個體三個層次研究, 綜合分析.關於基因的表達和定位,可以這樣去做:1. mRNA水平檢測基因表達:選擇表達目的基因的組織/細胞(發育不同時期、機體不同部位、加處理因素...),提取RNA,反轉錄,做RT-PCR或real time RT-PCR,檢測基因的表達情況/變化。(或者以northern blot、Rnase protection assay方法,檢測基因的mRNA表達情況/變化。)2. 蛋白質水平檢測基因表達:選擇相應的組織/細胞,以Western blot、免疫組化(OR免疫熒光)檢測目的蛋白的表達。

    3. 檢測目的蛋白的細胞定位:將目的基因克隆至帶熒光標籤(如GFP)的表達載體,在適合的模式細胞中表達,在活細胞中觀察蛋白的細胞定位。

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