引物設計引數：a引物長度一般在20bp左右，上下游引物鹼基長度不要相差超過4個鹼基。b引物退火溫度一般在58度，不同軟體TM使用不同的演算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以設定在55-58度，beacondesign可以設定在65左右。cGC含量一般沒什麼特殊要求，40-60最好，如果不好設計，30-80也是可以的。d產物長度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不易區分，超過200bp可能會影響PCR擴增效率。e軟體給出的引物不能有髮卡結構和超過3-4個鹼基的匹配，特別是3`端不能有鹼基匹配，那樣更容易形成二聚體。f引物設計好以後，在NCBI上做一個primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴增。

rt-pcr和一般的pcr相比原理上沒有太多的區別，無非就是在反轉時候rna的定量，不同模板的設定。對引物沒有特別的要求，能特異代表目的基因就行。

real-timepcr根據原理的不同，引物選擇也不同。通常用的是sybrgreen的方法，這種方法引物在rt-pcr的基礎上需要注意：1.退火溫度同內參；2.片段長度不要超過200；

real-timepcr的引物可以跑rt-pcr，反之不一定。