透過引物的引數檢測

引物設計引數：

a

引物長度一般在20bp左右，上下游引物鹼基長度不要相差超過4個鹼基。

b

引物退火溫度一般在58度，不同軟體TM使用不同的演算法，primer3，primer

5，primer

6，primer

express等一般可以設定在55-58度，beacon

design可以設定在65左右。

c

GC含量一般沒什麼特殊要求，40-60最好，如果不好設計，30-80也是可以的。

d

產物長度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不好區分，超過200bp可能會影響PCR擴增。

e

軟體給出的引物不能有髮卡結構和超過3-4個鹼基的匹配，特別是3`端不能有鹼基匹配，那樣更容易形成二聚體。

f

引物設計好以後，在NCBI上做一個primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴增。

最好還是透過實驗驗證，如果是定量PCR引物

a

溶解曲線單峰，窄而尖，否則可能有非特異性擴增；峰的位置橫座標一般在80度以上，這個溫度為PCR產物的解鏈溫度，如果在75度附近，可能是引物二聚體，miRNA染料法檢測時，溶解曲線的峰的位置可能在75度附件

b

瓊脂糖電泳為明亮的一條帶，條帶一般在100bp以上，如果設計引物時PCR產物在100bp一下，需要仔細辨認是否為引物二聚體；引物二聚體的條帶一般在50bp左右，條帶彌散，暗。

c

擴增曲線呈“S”形，一般情況下，S形越陡，擴增效率越高，S形越平，擴增效率低。有時會出現擴增曲線只有線性期，沒有指數期的情況，這時一般擴增效率較低，建議檢測一下擴增效率，用標準曲線法計算相對錶達量。染料法的擴增曲線比探針法的擴增曲線要好看。

d

樣品Ct值小於30，對於Ct大於30的情況，建議重新設計一對引物，重新除錯。如果幾對引物的Ct值都較大，可以適當放寬Ct至35。但是Ct值肯定不能大於35。