引物設計有 3 條基本原則：
引物與模板的序列要緊密互補。
引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構。
再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。
引物設計
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補。
在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重複迴圈，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。
PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關係到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅永珍的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。
引物設計有 3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。具體實現這 3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及髮夾結構（duplexformation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。
設計要求
做Real Time時,用於SYp Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的引數是不同的。引物設計的要求：
避免重複鹼基，尤其是G。
Tm=58-60度。
GC=30-80%。
3"端最後5個鹼基內不能有多於2個的G或C。
正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。
引物的退火溫度要高，一般要在60度以上。
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA汙染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA汙染的影響。
做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做汙染的預防工作。對於引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不容易。
關於BLAST的作用應該是透過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在GENEBANK中公開的全部物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。
引物設計有 3 條基本原則：
引物與模板的序列要緊密互補。
引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構。
再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。
引物設計
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補。
在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重複迴圈，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。
PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關係到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅永珍的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。
引物設計有 3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。具體實現這 3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及髮夾結構（duplexformation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。
設計要求
做Real Time時,用於SYp Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的引數是不同的。引物設計的要求：
避免重複鹼基，尤其是G。
Tm=58-60度。
GC=30-80%。
3"端最後5個鹼基內不能有多於2個的G或C。
正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。
引物的退火溫度要高，一般要在60度以上。
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA汙染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA汙染的影響。
做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做汙染的預防工作。對於引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不容易。
關於BLAST的作用應該是透過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在GENEBANK中公開的全部物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。