293T細胞的培養 ：
293T細胞是由293 細胞派生, 表達SV40 大T抗原的人腎上皮細胞系, 被廣泛應用於瞬時轉染以過表達各種目標蛋白, 或是用以包裝病毒。 293T 為貼壁細胞, 這種細胞對培養基的營養成分要求並不高。
培養條件為:
完全培養基: 高糖 DMEM, 10% 胎牛血清; 凍存液: 胎牛血清或完全培養基, 10% DMSO。
傳代方法為:
1．吸掉293T 細胞培養瓶內的培養液;
2．吸取適量的無Ca2+ 和Mg2+ 的PBS, 輕輕把貼壁的細胞洗兩遍;
3．加少量的0.05% 胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2 的培養瓶加1 ml, 75 cm2 的培養瓶加2~3 ml), 放到培養箱溫育20 s;
4．細胞消化完畢, 加適量培養液終止消化, 並吹打細胞, 製成均勻的細胞懸液;
5．加足量的培養液, 分裝到新的培養瓶中。值得注意的是, 293T細胞的貼壁性不強, 輕微的干擾就可能使它們脫落。所以, 在更換新鮮培養液或者用PBS沖洗的時候應該小心地新增新的培液進去, 以液體不衝打到貼壁的細胞為好。
6、
傳代的時候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可輕鬆把細胞消化下來, 不需要消化很長時間。有些同學反映293T
細胞容易結團不易被吹開啟來。如果遇到這樣的情況可以在加了胰蛋白酶溫育一段時間後即拿1 ml 移液槍反覆輕輕吹打, 直至肉眼看不到大的細胞塊為止,
7、加適量的培養液混勻, 這時候在顯微鏡下觀察, 可見大多數細胞都是單個的, 只有少量的2~3個細胞聚在一起。一般293T 細胞可以長在塑膠的培養瓶底面上直到90% 融合, 再以1∶4~1∶8 的比率傳代。合適的傳代週期為2~3 天。
8、傳代過程中, 消化的時間越短越好, 顯微鏡下觀察到80%細胞脫落即可加培養液中止。
完成傳代後放入培養箱前：
應該把培養瓶或培養皿沿X、Y軸方向水平移動幾下, 防止細胞都聚在中間或者四周。冷凍293T 細胞的凍存液可以用95% 小牛血清加5% 二甲基亞碸, 復甦率很高。
293T細胞的生長狀態直接關係到包裝病毒和轉染的效率, 應儘量選擇傳代次數少, 培養總時間短的細胞。從細胞形態上看, 相差顯微鏡下觀察立體感強並且形態良好的細胞產病毒率或者轉染效率都很高。
雖
然293T細胞的應用非常廣泛, 幾乎每個實驗室都有一株自己的293T 細胞株, 但是經常有同學提出: 為什麼在正常的培養條件下,
細胞卻很難傳代下去, 包裝病毒效率很低, 對轉染效率也不滿意呢？ 事實上,
引起類似問題的元兇是一種生物界最小的原核細胞生物－支原體。支原體汙染後, 它們不會使細胞死亡而是與細胞長期共存, 培養基不發生渾濁,
細胞無明顯變化, 外觀上給人以正常感覺, 但事實上細胞正在受到到多方面影響, 如引起細胞變形, 影響DNA 合成,
抑制細胞生長等。我們曾經收集到四株分別來自四個不同實驗室的293T 細胞, 經檢測均為支原體陽性,
令人驚訝的是這四株細胞都已經不是典型的293T 細胞形態, 每兩株之間比較竟然形狀各不相同,
很難相信這是同一種細胞！這些支原體陽性細胞普遍傳代週期長, 顯微鏡下觀察細胞碎片多, 長期支原體感染已經使這些細胞羸弱不堪, 胞內DNA
和蛋白質合成受到嚴重的影響。 因此, 有效地防治支原體汙染, 杜絕交叉感染對提高實驗效率,
穩定實驗結果至關重要。我們的經驗是把防治支原體汙染作為細胞培養的一項日常工作, 除了對細胞培養裝置環境的清潔外, 還需在器材消毒, 操作員培訓,
嚴格把關新引入細胞株的質量等方面做大量細緻的工作。
293T細胞的培養 ：
293T細胞是由293 細胞派生, 表達SV40 大T抗原的人腎上皮細胞系, 被廣泛應用於瞬時轉染以過表達各種目標蛋白, 或是用以包裝病毒。 293T 為貼壁細胞, 這種細胞對培養基的營養成分要求並不高。
培養條件為:
完全培養基: 高糖 DMEM, 10% 胎牛血清; 凍存液: 胎牛血清或完全培養基, 10% DMSO。
傳代方法為:
1．吸掉293T 細胞培養瓶內的培養液;
2．吸取適量的無Ca2+ 和Mg2+ 的PBS, 輕輕把貼壁的細胞洗兩遍;
3．加少量的0.05% 胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2 的培養瓶加1 ml, 75 cm2 的培養瓶加2~3 ml), 放到培養箱溫育20 s;
4．細胞消化完畢, 加適量培養液終止消化, 並吹打細胞, 製成均勻的細胞懸液;
5．加足量的培養液, 分裝到新的培養瓶中。值得注意的是, 293T細胞的貼壁性不強, 輕微的干擾就可能使它們脫落。所以, 在更換新鮮培養液或者用PBS沖洗的時候應該小心地新增新的培液進去, 以液體不衝打到貼壁的細胞為好。
6、
傳代的時候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可輕鬆把細胞消化下來, 不需要消化很長時間。有些同學反映293T
細胞容易結團不易被吹開啟來。如果遇到這樣的情況可以在加了胰蛋白酶溫育一段時間後即拿1 ml 移液槍反覆輕輕吹打, 直至肉眼看不到大的細胞塊為止,
7、加適量的培養液混勻, 這時候在顯微鏡下觀察, 可見大多數細胞都是單個的, 只有少量的2~3個細胞聚在一起。一般293T 細胞可以長在塑膠的培養瓶底面上直到90% 融合, 再以1∶4~1∶8 的比率傳代。合適的傳代週期為2~3 天。
8、傳代過程中, 消化的時間越短越好, 顯微鏡下觀察到80%細胞脫落即可加培養液中止。
完成傳代後放入培養箱前：
應該把培養瓶或培養皿沿X、Y軸方向水平移動幾下, 防止細胞都聚在中間或者四周。冷凍293T 細胞的凍存液可以用95% 小牛血清加5% 二甲基亞碸, 復甦率很高。
293T細胞的生長狀態直接關係到包裝病毒和轉染的效率, 應儘量選擇傳代次數少, 培養總時間短的細胞。從細胞形態上看, 相差顯微鏡下觀察立體感強並且形態良好的細胞產病毒率或者轉染效率都很高。
雖
然293T細胞的應用非常廣泛, 幾乎每個實驗室都有一株自己的293T 細胞株, 但是經常有同學提出: 為什麼在正常的培養條件下,
細胞卻很難傳代下去, 包裝病毒效率很低, 對轉染效率也不滿意呢？ 事實上,
引起類似問題的元兇是一種生物界最小的原核細胞生物－支原體。支原體汙染後, 它們不會使細胞死亡而是與細胞長期共存, 培養基不發生渾濁,
細胞無明顯變化, 外觀上給人以正常感覺, 但事實上細胞正在受到到多方面影響, 如引起細胞變形, 影響DNA 合成,
抑制細胞生長等。我們曾經收集到四株分別來自四個不同實驗室的293T 細胞, 經檢測均為支原體陽性,
令人驚訝的是這四株細胞都已經不是典型的293T 細胞形態, 每兩株之間比較竟然形狀各不相同,
很難相信這是同一種細胞！這些支原體陽性細胞普遍傳代週期長, 顯微鏡下觀察細胞碎片多, 長期支原體感染已經使這些細胞羸弱不堪, 胞內DNA
和蛋白質合成受到嚴重的影響。 因此, 有效地防治支原體汙染, 杜絕交叉感染對提高實驗效率,
穩定實驗結果至關重要。我們的經驗是把防治支原體汙染作為細胞培養的一項日常工作, 除了對細胞培養裝置環境的清潔外, 還需在器材消毒, 操作員培訓,
嚴格把關新引入細胞株的質量等方面做大量細緻的工作。