鋪好薄層（矽膠）的玻璃板簡稱薄板，將含A B組分的試樣溶液點在薄板的一端，然後放於封閉色譜槽中，用適當的展開劑（流動相）展開，當展開劑攜帶樣品透過吸附劑時，A B兩組分就在吸附劑和展開劑之間不斷吸附、解吸附（溶解），再吸附、再解吸附。極性大小不同，移動快慢不同。極性小上移快，展開劑極性越大，上移越快。用Rf表示。同種化合物在同樣條件下，應具有相同的Rf值,可用於物質的鑑定。矽膠的表面存在著矽醇基團(si-oh)和暴露的矽氧烷鍵(si-o-si)。矽醇基團是強吸附的極性基團。矽膠層析是根據物質在矽膠上的吸附力不同而使物質分離， 一般情況下極性較大的物質易被矽膠吸附，極性較弱的物質不易被矽膠吸附。反相矽膠就是C8或者C18矽膠,極性很小,在柱子上面,基本上是極性大的先出來,極性越小越慢出來 正相柱相反,極性大的後出來,極性越小越容易衝出來。

在條件完全一致的情況，純碎的化合物在薄層色譜中呈現一定的移動距離，稱比移值（Rf值），所以利用薄層色譜法可以鑑定化合物的純度或確定兩種性質相似的化合物是否為同一物質。但影響比移值的因素很多，如薄層的厚度，吸附劑顆粒的大小，酸鹼性，活性等級，外界溫度和展開劑純度、組成、揮發性等。所以，要獲得重現的比移值就比較困難。為此，在測定某一試樣時，最好用已知樣品進行對照。