一、細胞復甦
將凍存細胞從液氮中取出後，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。
加入10ml DMEM培養基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養基，輕輕吹打，接種於10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。
二、細胞傳代
細胞密度達到80%~90%時．去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1ml DMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。
加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經高壓滅菌，保存於40C），吹勻，吸取10微升進行計數，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。
三、細胞凍存
細胞密度達到80%～90%時，去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。
加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過夜，第二天放入液氮中，可以儲存至少兩年，如不放人液氮，可以儲存三個月。
凍存液的配製：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
注意事項
（1）進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：
①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。
②確定衣服的袖口已經卷起或者白大褂的袖口已經紮緊。
④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋鬆。
⑤儘量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）後在火焰上簡單燒灼。
⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔淨的，必須及時更換。
⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。
（2）細胞汙染的預防
①實驗用品防止汙染。細胞培養所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌要仔細，並在無菌實驗檢測陰性後才能使用。操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。
②操作過程防止汙染。
④實驗開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全櫃之外的物品，必須及時對手套進行消毒。
⑤進入細胞培養間後關好門，坐下來儘量少走動以免影響生物安全櫃的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把汙染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大規模汙染。
⑥細胞操作時動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內開啟瓶口，並將瓶口放在火焰周圍簡單轉動燒灼，注意不要讓火焰把塑膠瓶口燒化。
⑦實驗操作時生物安全櫃的隔板要儘可能放低，儘量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區，以免造成不必要的汙染。
⑨不要從敞開的容器口上方經過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的汙染。
⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發現接觸了非潔淨或者無法確定潔淨的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。
（3）防止細胞交叉汙染
①在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，最好作上標記便於辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發生t昆亂。
②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養基中汙染其他細胞。
一、細胞復甦
將凍存細胞從液氮中取出後，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。
加入10ml DMEM培養基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養基，輕輕吹打，接種於10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。
二、細胞傳代
細胞密度達到80%~90%時．去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1ml DMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。
加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經高壓滅菌，保存於40C），吹勻，吸取10微升進行計數，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。
三、細胞凍存
細胞密度達到80%～90%時，去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。
加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過夜，第二天放入液氮中，可以儲存至少兩年，如不放人液氮，可以儲存三個月。
凍存液的配製：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
注意事項
（1）進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：
①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。
②確定衣服的袖口已經卷起或者白大褂的袖口已經紮緊。
④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋鬆。
⑤儘量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）後在火焰上簡單燒灼。
⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔淨的，必須及時更換。
⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。
（2）細胞汙染的預防
①實驗用品防止汙染。細胞培養所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌要仔細，並在無菌實驗檢測陰性後才能使用。操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。
②操作過程防止汙染。
④實驗開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全櫃之外的物品，必須及時對手套進行消毒。
⑤進入細胞培養間後關好門，坐下來儘量少走動以免影響生物安全櫃的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把汙染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大規模汙染。
⑥細胞操作時動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內開啟瓶口，並將瓶口放在火焰周圍簡單轉動燒灼，注意不要讓火焰把塑膠瓶口燒化。
⑦實驗操作時生物安全櫃的隔板要儘可能放低，儘量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區，以免造成不必要的汙染。
⑨不要從敞開的容器口上方經過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的汙染。
⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發現接觸了非潔淨或者無法確定潔淨的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。
（3）防止細胞交叉汙染
①在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，最好作上標記便於辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發生t昆亂。
②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養基中汙染其他細胞。