常見問題以及解決方法

問題 1：轉膜不充分

(1) 膜沒有完全均勻溼透

使用 100% methanol 浸透膜。

(2) 靶蛋白分子量小於 10 000

選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間。

(3) 靶蛋白等電點等於或接近轉移緩衝液 pH 值

可嘗試使用其他緩衝液如 CAPS 緩衝液（pH 10.5) 或使用低 pH 值緩衝液如乙酸緩衝液。

(4) 甲醇濃度過高

過高甲醇濃度會導致蛋白質與 SDS 分離，從而沉澱在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替。

(5) 轉移時間不夠

對於厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間。

問題 2：背景高

(1) 膜沒有完全均勻溼透

使用 100% methanol 浸透膜。

(2) 洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數。

(3) 阻斷不充分

增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。

(3) 二抗濃度過高

降低二抗濃度。

(4) 檢測過程中膜乾燥

保證充分的反應液，避免出現幹膜現象。

(5) 曝光過度

縮短曝光時間。

(6) 抗體與阻斷蛋白有交叉反應

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應。

問題 3：沒有陽性條帶

（1）抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間。

（2）酶失活

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。

（3）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設定陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

（4）試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。透過設定內參照可以驗證二級檢測系統的有效性。

（5）一抗失效

選擇在有效期內抗體；並選擇現配現用的工作液。

（6）HRP 抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

問題 4：有陽性條帶，但條帶比較弱

（1）抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間。

（2）酶活性降低

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。

（3）標本中靶蛋白含量太低

增加標本上樣量。

（4）洗膜過度

縮短洗滌時間。

（5）HRP 抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

（6）抗體活性降低

選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置。

（7）封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑型別。

（8）曝光時間過短

延長曝光時間。

（9）HRP 抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

問題 5：條帶位置（大小）不對；或有非特異性條帶

（1）二抗的非特異性結合

（2）一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性。

（3）蛋白降解

使用新鮮製備的標本，並使用蛋白酶抑制劑。

（4）二聚體或多聚體存在

增加蛋白質變性過程及強度。

（5）抗體濃度過高

降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶。

（6）蛋白上樣量過大

降低上樣量。

問題 6：背景有斑點

（1）封閉劑中有聚集體

使用前過濾封閉試劑。

（2）HRP 耦聯二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體。