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  • 1 # MR任任任

    這個問題涉及到遺傳轉化體系中受體材料的選擇和處理。

    農桿菌(屬於革蘭氏陰性細菌)作為一種天然高效的轉基因載體,在植物的遺傳轉化上具有廣泛的應用。它能在一定條件下趨化性地感染植物的受傷部位,並誘導產生冠癭瘤或髮狀根。

    自然界中存在的農桿菌包括根癌農桿菌 (A.tumefaciens) 和髮根農桿菌(A.rhizogenes) 。根癌農桿菌的Ti質粒基因轉化是最常見、應用最廣泛的基因轉化途徑,轉基因植物中80%以上是利用根癌農桿菌介導的,它具有遺傳穩定、易於轉化大片段DNA、操作簡單、成本低廉等優點。

    目前農桿菌介導的遺傳轉化體系,已經成功在多種作物中建立。比如水稻、小麥、玉米、穀子、大豆、糜子、早熟禾、擬南芥、菸草、茶樹、馬鈴薯、甜椒、雙孢菇、鐵棍山藥、黃瓜、南瓜、羽衣甘藍、蘋果、橘子、葡萄、薄皮甜瓜等……

    農桿菌菌株的侵染能力是轉化成功的前提。目前在遺傳轉化體系的研究中,應用最廣泛的農桿菌菌株有EHA105、GV3101、LBA4404、C58、A281等。雖然目前用於遺傳轉化的農桿菌類型很多,但不同的農桿菌,侵染後胚的再生能力存在差異,侵染後受體材料脫分化快慢不一,轉化效率和抗性植株比例不同。因此針對不同種質選擇合適的農桿菌菌株是獲得轉基因材料的重要前提。我們平時做的多的是水稻和擬南芥的遺傳轉化。對於基因功能研究,轉基因是一項很重要的技術手段。水稻遺傳轉化時常用的菌株是EHA105,擬南芥遺傳轉化時常用的菌株是GV3101。

    開展遺傳轉化的首要任務就是要建立良好的受體系統。

    受體系統是將用於轉化的外植體透過組織培養或非組培途徑獲得的,能高效、穩定地再生無性系,並能接受外源DNA整合,對轉化選擇抗生素敏感的再生系統。好的受體系統必須滿足以下幾個條件:1.分化及再生能力強;2.遺傳穩定性較高;3.外植體或植物組織來源穩定;4.外源基因的匯入易於操作;5.對選擇性篩選劑敏感。

    對於不同植物材料的轉基因,選取的受體系統是不一樣的。有的受體系統基本不需要損傷,有的需要切出傷口,有的需要製備成愈傷組織。

    轉化擬南芥,最簡單快捷的方法就是浸花法,用抽薹開花的花序作轉基因受體進行浸染,將花序浸泡在含有農桿菌的侵染液中數分鐘,期間來回翻動,將植株上所有的花骨朵和花蕾浸染完全,然後等果莢成熟收穫篩選即可。

    轉化水稻、小麥、穀子、早熟禾、甜椒、山藥等大多數植物,最常用的是以愈傷組織作為轉化受體,對幼胚或種子進行誘導,獲得胚性愈傷組織,用農桿菌菌液對其浸泡,進而培養、分化、篩選,得到轉基因材料。

    轉化水稻、蕎麥,還可以用切除胚芽鞘/子葉片後剩下的莖尖作轉基因受體,用農桿菌菌液對其浸泡,進而培養、分化、篩選,得到轉基因材料。

    轉化油菜、羽衣甘藍,可以用子葉、子葉片、子葉柄、下胚軸等作轉基因受體,用農桿菌菌液對其浸泡,進而培養、分化、篩選,得到轉基因材料。子葉柄易於長出不定芽,下胚軸和子葉片需要先從基部或切口長出愈傷而後分化為不定芽。

    其他受體系統:如原生質體、懸浮細胞、未成熟的幼胚等。

    植物傷口所釋放的酚類物質是誘導細菌附著到受體的重要因子之一,酚類物質能夠活化Vir基因,為後續的T-DNA轉運和整合做好準備。已有研究證實,乙醯丁香酮、羥基乙醯丁香酮、間二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、兒茶酚、原兒茶酸、沒食子酸、香草醛等酚類物質是有效轉化誘導物質。我們也經常在侵染液中新增乙醯丁香酮增強轉化效果。

    微生物侵染植物,可以從傷口侵入,也可以從自然孔口(如氣孔、皮孔、花粉管等)侵入。

    像浸花法侵染擬南芥,就不需要對植物造成額外的傷害。所以,並不是所有的受體材料都要受損傷。

  • 2 # 大大小問號

    當然是必要的!

    所謂的植物受損是為了暴露出表皮以內的柔嫩的部分,這部分細菌才能很好的侵蝕進入。至於表皮是一層緻密的保護層,是難以入侵的,只有受損以後,傷口部位才更容易感染農桿菌。人工轉化中,可以認為切口,或者打孔或者打點滴,這都是可以的。但是無論哪一種方法,都會破壞表皮的。

    此外,至於表皮是沒有可以讓細菌利用的營養物質的,一旦植物受損,那麼必然會就出汁液,這些汁液裡面含有細菌生存所需的糖類和無機鹽等,可以讓細菌生活在裡面並且大量導致,只有細菌大量繁殖以後才有機會完成轉化過程。因為這種轉化不是必然成功的,是一個機率事件,所以細菌數量夠大,機會也就大了很多。

    如果植物沒有受傷,那麼它們就有了表皮這樣的天然屏障,農桿菌很難進去,自然也就無法導致,並完成轉化過程,因此損傷是必要的。

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