X晶體衍射。首先要得到蛋白質的晶體。通常，都是將表達蛋白的基因PCR之後克隆到一種表達載體中，然後在大腸桿菌中誘導表達，提純之後摸索結晶條件，等拿到晶體之後，工作便完成的80％，將晶體進行x射線衍射，收集衍射圖譜，透過一系列的計算，很快就能得到蛋白質的原子結構。所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結晶的條件。X射線衍射方向決定於晶體的週期或晶面間隔，但是，在週期相同或晶面間隔相同的情況下，由於晶胞內原子排布方式不同，則會造成衍射點強度不同。也就是說，衍射點強度的大小包含著與分子結構有關的資訊。分子結構中所有原子對每一個衍射斑點的強度都有各自的貢獻，因此，透過分析X射線衍射點的強度，可以得到有關晶胞內原子排布的資訊。常用的晶體衍射強度的記錄有兩種方式。一種是將晶體所產生的衍射光束點記錄在底片上，如經典的感光膠片，然後，用掃描器閱讀衍射強度。近年來發展起來的象板探測器，實際上是用象板取代了感光膠片，免除了顯影、定影等麻煩。另一種方法是多絲正比面探測器，先將衍射光束光子訊號轉換為電子訊號，再處理為衍射強度。還可以採用CCD技術，使資料採集精度和訊號轉換速度得到較大的提高。這非常重要，因為生物大分子晶體結構解析的解析度和精度主要取決於晶體衍射資料採集的質量和精度。多波長反常散射法成為近年來發展較快的一種方法。生物大分子中通常含有金屬離子或重原子，不同的原子對不同波長的X射線具有特徵的反常散射效應。同步輻射光源具有強度高、單色性好、波長連續可調的特點，在進行生物大分子晶體衍射實驗時，如果晶體中含有金屬離子或重原子，則可以將同步輻射光源的波長調整到對應原子反常散射明顯的位置，獲得反常散射資料，從而進行晶體結構的解析。生物大分子的二級結構常常是螺旋結構（如蛋白質中的a螺旋和DNA的雙螺旋），其特點是每一圈螺旋中(即每一週期)包含一定數量的、散射能力相同的結構單元。具有螺旋結構的生物大分子，其X射線衍射圖有相應的特點。凡是衍射圖上具有這些特點的物質，如纖維狀蛋白質、DNA，其結構均為螺旋結構。利用從衍射圖得到的衍射資料，可以分析出晶胞內三維空間的電子密度分佈，確定結構模型。下面以肌紅蛋白為例加以說明。肌紅蛋白分子量為18000，含有153個氨基酸殘基，分子中有1200個原子(不包括氫原子)。為了定出分子中所有原子的位置，需要測量大約20000個衍射點的強度並計算其位相角。第一階段分析到6的水平，定出多肽鏈和正鐵血紅素的位置，其中棒狀結構符合a-螺旋的特徵，推算出a-螺旋約佔殘基總數的70%。進一步分析提高到2的水平，雖然不能定出每個原子的位置，但可以肯定分子的主要部分是由a-螺旋組成，而且是右手螺旋，鏈必須彎曲、盤繞。其中大約13~18個殘基不是a-螺旋，一半以上的氨基酸殘基能定出種類。再進一步分析到1.5的水平，可以完全弄清楚氨基酸排列順序。這樣，透過X射線衍射的研究，可以確定蛋白質一級、二級、三級結構。可見X射線衍射分析是研究生物大分子結構的強有力的工具。用X射線衍射技術分析分子結構時，一般有以下幾個步驟：（1）用實驗測定單個晶格的線度和從衍射圖中測量衍射點的強度；（2）根據上述資料，結合其它方法推斷原子排列，得到嘗試結構模型，計算這種結構的衍射極大值，然後與實驗觀察值比較；（3）修正所提出的模型，直到計算結果和實際所得到的資料趨於吻合。X射線晶體學方法是測定蛋白質結構的主要方法。球狀蛋白質是多肽鏈捲曲成團的蛋白質，它和纖維狀蛋白不同，構型一般比較複雜。球狀蛋白質分子量大，表面基團的構象不穩定，要獲得有序排列的晶體是比較困難的。所形成的晶體不可能是完美的堆砌，而是會在分子之間形成許多大的孔或通道。這些通道常常由佔晶體體積一半以上的溶劑分子所佔有，而溶劑分子的絕大部分在晶體上又是無序的。晶體中的蛋白質分子之間僅有少量的區域發生接觸，這些區域的相互作用也是較弱的相互作用，通常是透過一個或幾個溶劑分子發生作用。蛋白質晶體的形成依賴於一些引數，如pH值、溫度、蛋白濃度、溶劑的種類、沉澱劑的種類以及金屬離子和某些蛋白的配基等。用X射線衍射圖分析DNA的空間結構，出現螺旋結構的衍射圖樣，說明每一圈螺旋有10個重複結構單元，反映了分子間的排列情況。根據DNA的X射線衍射圖結合其它技術，Watson和Crick提出了DNA的空間結構模型：兩條多核苷酸鏈組成反平行的右手雙螺旋，磷酸在外，鹼基在內；螺距為34，每圈螺旋包含10個核苷酸，每個核苷酸軸長為3.4，螺旋直徑為20；兩條鏈之間形成氫鍵。

蛋白質三級結構測定主要有X射線衍射法、核磁共振技術、三維電鏡重構技術三種方法。X線晶體衍射是最經典的測定生物大分子結構的方法。蛋白質晶體衍射中最大的難點就在於蛋白質的結晶，也在一定程度上限制了它的發展。NMR技術後起之秀，相對於X-RAY較為簡單，近年來技術越發成熟，可測定蛋白質的分子量也在攀升，而且其解析度也很高，三維電鏡重構技術也是結構生物學研究中的一種較新的技術。技術難點在於演算法。