首先由丙酮酸羧化酶催化，將丙酮酸轉變為草醯乙酸，然後再由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化，由草醯乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。 這個過程中消耗兩個高能鍵（一個來自ATP，另一個來自GTP），而由磷酸烯醇式丙酮酸分解為丙酮酸只生成1個ATP。 由於丙酮酸羧化酶僅存在於線粒體內，胞液中的丙酮酸必須進入線粒體，才能羧化生成草醯乙酸，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶線上粒體和胞液中都存在，因此草醯乙酸可線上粒體中直接轉變為磷酸烯醇式丙酮酸再進入胞液中，也可在胞液中被轉變為磷酸烯醇式丙酮酸。但是，草醯乙酸不能透過線粒體膜，其進入胞液可透過兩種方式將其轉運：一種是經蘋果酸脫氫酶作用，將其還原成蘋果酸，然後透過線粒體膜進入胞液，再由胞液中NAD+-蘋果酸脫氫酶將蘋果酸脫氫氧化為草醯乙酸而進入糖異生反應途徑，由此可見，以蘋果酸代替草醯乙酸透過線粒體膜不僅解決了糖異生所需要的碳單位，同時又從線粒體內帶出一對氫，以NADH+H+形成使1，3-二磷酸甘油酸生成3磷酸甘油醛，從而保證了糖異生順利進行。另一種方式是經穀草轉氨酶的作用，生成天門冬氨酸後再逸出線粒體，進入胞液中的天門冬氨酸再經胞液中谷草轉氨酶催化而恢復生成草醯乙醯。有實驗表明，以丙酮酸或能轉變為丙酮酸的某些成糖氨基酸作為原料成糖時，以蘋果酸透過線粒體方式進行糖異生，而乳糖進行糖異生反應時，它在胞液中變成丙酮酸時已脫氫生成NADH+H+，可供利用，故常線上粒體內生成草醯乙酸後，再變成天門冬氨酸而出線粒體內膜進入胞漿。
首先由丙酮酸羧化酶催化，將丙酮酸轉變為草醯乙酸，然後再由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化，由草醯乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。 這個過程中消耗兩個高能鍵（一個來自ATP，另一個來自GTP），而由磷酸烯醇式丙酮酸分解為丙酮酸只生成1個ATP。 由於丙酮酸羧化酶僅存在於線粒體內，胞液中的丙酮酸必須進入線粒體，才能羧化生成草醯乙酸，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶線上粒體和胞液中都存在，因此草醯乙酸可線上粒體中直接轉變為磷酸烯醇式丙酮酸再進入胞液中，也可在胞液中被轉變為磷酸烯醇式丙酮酸。但是，草醯乙酸不能透過線粒體膜，其進入胞液可透過兩種方式將其轉運：一種是經蘋果酸脫氫酶作用，將其還原成蘋果酸，然後透過線粒體膜進入胞液，再由胞液中NAD+-蘋果酸脫氫酶將蘋果酸脫氫氧化為草醯乙酸而進入糖異生反應途徑，由此可見，以蘋果酸代替草醯乙酸透過線粒體膜不僅解決了糖異生所需要的碳單位，同時又從線粒體內帶出一對氫，以NADH+H+形成使1，3-二磷酸甘油酸生成3磷酸甘油醛，從而保證了糖異生順利進行。另一種方式是經穀草轉氨酶的作用，生成天門冬氨酸後再逸出線粒體，進入胞液中的天門冬氨酸再經胞液中谷草轉氨酶催化而恢復生成草醯乙醯。有實驗表明，以丙酮酸或能轉變為丙酮酸的某些成糖氨基酸作為原料成糖時，以蘋果酸透過線粒體方式進行糖異生，而乳糖進行糖異生反應時，它在胞液中變成丙酮酸時已脫氫生成NADH+H+，可供利用，故常線上粒體內生成草醯乙酸後，再變成天門冬氨酸而出線粒體內膜進入胞漿。