李時珍在數十年行醫以及閱讀古典醫籍的過程中，發現古代本草書中存在著不少錯誤，決心重新編纂一部本草書籍。

明世宗嘉靖三十一年(1552年)，李時珍著手開始編寫《本草綱目》，以《證類本草》為藍本，參考了800多部書籍，其間，從嘉靖四十四年(1565年)起，多次離家外出考察，足跡遍及湖廣、江西、直隸許多名山大川，弄清了許多疑難問題。

在編寫《本草綱目》的過程中，最使李時珍頭痛的就是由於藥名混雜，往往弄不清藥物的形狀和生長的情況。過去的本草書，雖然作了反覆的解釋，但是由於有些作者沒有深入實際進行調查研究，而是在書本上抄來抄去，所以越解釋越糊塗，而且矛盾百出，使人莫衷一是。

例如藥物遠志，南北朝著名醫藥學家陶弘景說它是小草，象麻黃，但顏色青，開白花，宋代馬志卻認為它象大青，並責備陶弘景根本不認識遠志。又如狗脊一藥，有的說它象萆薢，有的說它象拔葜，有的又說它象貫眾，說法很不一致。

在他父親的啟示下，李時珍認識到，“讀萬卷書“固然需要，但“行萬里路“更不可少。於是，他既“蒐羅百氏“，又“採訪四方“，深入實際進行調查。

經過27年的長期努力，於明神宗萬曆六年(1578年)完成《本草綱目》初稿，時年61歲。以後又經過10年三次修改，前後共計40年。萬曆二十二年(公元1593年)去世。萬曆二十五年(1596年)，也就是李時珍逝世後的第三年，《本草綱目》在金陵(今南京)正式刊行。