分光光度計分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩衝液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸在波長 260 nm處有最高吸收峰。吸收紫外光的性質是嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵系統所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能區分DNA和RNA，只能用來鑑定核酸的純度和含量。蛋白質由於含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質的吸收高峰在280nm波長處，在260nm處的吸收值公為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右。當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降。分光光度計採用一個可以產生多個波長的光源，透過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品後，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。核酸的定量DNA和RNA都有吸收紫外光的性質，它們的吸收高峰在260nm波長處，每種核酸的分子構成不一， 因此其換算係數不同。定量不同型別的核酸，事先要選擇對應的係數。如：1OD 的吸光值分別相當於50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。測試後的吸光值經過上述係數的換算，從而得出相應的樣品濃度，這些由分光光度計內預設的程式執行，因此，測試前選擇正確的程式，測試樣品的型別，首先測試空白液，然後再測試樣品，注意輸入樣品稀釋倍數。如何避免吸光值漂移讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器， 表現出的吸光值漂移越大。事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定範圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。核酸本身物化性質溶解核酸的緩衝液的pH 值、離子濃度等在測試時，離子濃度太高也會導致讀數漂移，因此建議使用pH 值一定、離子濃度較低的緩衝液（如TE）可大大穩定讀數。核酸的吸光值受pH值和緩衝液離子濃度影響。只有在一定的pH值和低離子濃度的條件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精確的檢測結果。水的pH值不穩定，可能導致檢測誤差。一些緩衝液在紫外範圍內存在自身吸收，為了確保準確測量，請使用與懸浮或洗脫樣品時相同的緩衝液。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素，由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大於0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此範圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試範圍）。操作因素如混合要充分，否則吸光值太低， 甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算係數和樣品濃度單位選擇一致；不能採用視窗磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。各波長具體含義及相關問題1. A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的範圍為0.1至1.0。如果不在此範圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此範圍內；如果吸光度小於0.05，檢查是否存在操作因素（如移液不準確，樣品內有懸浮物等）影響。DNA樣品的A260 吸光度值是否>0.1。（請注意，這個值跟儀器無關，核酸的吸光度必需大於0.1，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值<0.1）；朗伯－比爾定律：A 吸光值I0 入射光強度I 投射光強度c 吸光物質的摩爾濃度（mol/L）d 光透過的液層厚度（cm）ε 摩爾吸光係數（Lmol-1cm-1）2. A280nm是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質的汙染，需要純化樣品。比值=1.5相當於50％蛋白質/DNA溶液3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小於2.0標明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑汙染，需要純化樣品。A230產生負值主要是由於在很低DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導致的。在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負值會被校正。4. A320nm或A340nm為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應該接近0.0。如果不是，標明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A320一般是 0。5. A260/A280和A260/A230是核酸純度的指示值，純度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值應該在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用於評估樣品的純度， 因為蛋白的吸收峰是280 nm。 純淨的樣品比值大於1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230是多肽、芳香基團、苯酚和一些碳氫化合物的吸光度，A230表示樣品中存在一些汙染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純淨的核酸A260/A230的比值大於2.0 。A280是蛋白質的吸光度。
分光光度計分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩衝液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸在波長 260 nm處有最高吸收峰。吸收紫外光的性質是嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵系統所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能區分DNA和RNA，只能用來鑑定核酸的純度和含量。蛋白質由於含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質的吸收高峰在280nm波長處，在260nm處的吸收值公為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右。當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降。分光光度計採用一個可以產生多個波長的光源，透過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品後，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。核酸的定量DNA和RNA都有吸收紫外光的性質，它們的吸收高峰在260nm波長處，每種核酸的分子構成不一， 因此其換算係數不同。定量不同型別的核酸，事先要選擇對應的係數。如：1OD 的吸光值分別相當於50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。測試後的吸光值經過上述係數的換算，從而得出相應的樣品濃度，這些由分光光度計內預設的程式執行，因此，測試前選擇正確的程式，測試樣品的型別，首先測試空白液，然後再測試樣品，注意輸入樣品稀釋倍數。如何避免吸光值漂移讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器， 表現出的吸光值漂移越大。事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定範圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。核酸本身物化性質溶解核酸的緩衝液的pH 值、離子濃度等在測試時，離子濃度太高也會導致讀數漂移，因此建議使用pH 值一定、離子濃度較低的緩衝液（如TE）可大大穩定讀數。核酸的吸光值受pH值和緩衝液離子濃度影響。只有在一定的pH值和低離子濃度的條件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精確的檢測結果。水的pH值不穩定，可能導致檢測誤差。一些緩衝液在紫外範圍內存在自身吸收，為了確保準確測量，請使用與懸浮或洗脫樣品時相同的緩衝液。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素，由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大於0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此範圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試範圍）。操作因素如混合要充分，否則吸光值太低， 甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算係數和樣品濃度單位選擇一致；不能採用視窗磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。各波長具體含義及相關問題1. A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的範圍為0.1至1.0。如果不在此範圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此範圍內；如果吸光度小於0.05，檢查是否存在操作因素（如移液不準確，樣品內有懸浮物等）影響。DNA樣品的A260 吸光度值是否>0.1。（請注意，這個值跟儀器無關，核酸的吸光度必需大於0.1，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值<0.1）；朗伯－比爾定律：A 吸光值I0 入射光強度I 投射光強度c 吸光物質的摩爾濃度（mol/L）d 光透過的液層厚度（cm）ε 摩爾吸光係數（Lmol-1cm-1）2. A280nm是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質的汙染，需要純化樣品。比值=1.5相當於50％蛋白質/DNA溶液3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小於2.0標明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑汙染，需要純化樣品。A230產生負值主要是由於在很低DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導致的。在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負值會被校正。4. A320nm或A340nm為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應該接近0.0。如果不是，標明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A320一般是 0。5. A260/A280和A260/A230是核酸純度的指示值，純度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值應該在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用於評估樣品的純度， 因為蛋白的吸收峰是280 nm。 純淨的樣品比值大於1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230是多肽、芳香基團、苯酚和一些碳氫化合物的吸光度，A230表示樣品中存在一些汙染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純淨的核酸A260/A230的比值大於2.0 。A280是蛋白質的吸光度。