1、 連線緩衝液的影響：大體上緩衝液含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的範圍在7.4-7.8，較多 用7.8，目的是提供合適酸鹼度的連線體系；10mmol/L的MgCl2，作用是啟用酶反應；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L， 作用是維持還原性環境，穩定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩衝液不同的是 連線酶緩衝液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現多用1mmol/L，是酶反應所必需的。 2、 pH的影響：一般將緩衝液的pH調節到7.4-7.8，較多用7.8。有實驗表明，若把pH為7.5-8.0時的酶活力定為100%，那麼體系偏鹼（pH為8.3）時僅為全部活力的65%；當體系偏酸（PH為6.9）時僅為全部活力的40%。 3、 ATP濃度的影響：連線緩衝液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發現，ATP的最適濃度為0.5-1mmol /L，過濃會抑制反應。例如，5mmol/L的ATP會完全抑制平末端連線，黏端的連線也有10%被抑制；還有報道，當ATP的濃度為0.1mmol/L 時，去磷酸載體的自環比例最大。由於ATP極易分解，所以當連線反應失敗時，除了DNA與酶的問題外，還應考慮ATP的因素。含有ATP的緩衝液應於 -20℃儲存，溶化取用後立即放回。連線緩衝液體積較大時最好分小管貯存，防止反覆凍融引起ATP分解。與限制酶緩衝液不同的是，含ATP的連線緩衝液長 期放置後往往失效，所以也可自行配製不含ATP的緩衝液（可長期儲存），臨用時加入新配製的ATP母液。 4、 連線溫度與時間的影響：因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩定，但連線酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經 過綜合考慮後，傳統上將連線溫度定為16℃，時間為4-16h。現經實驗發現，對於一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當好的連線效果，當然如果時間充裕的話，20℃ 60min能使連線反應進行得更完全一些。對於平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發揮。 5、 酶濃度的影響：日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態低10-20倍，連線平末端時酶用量要比連線黏端大10-100倍。進行黏末端連線時需先行稀釋，稀釋液的成分與酶儲存緩衝液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便於隨時取用。 6、 DNA濃度的影響：要求得到環化的有效連線產物， DNA濃度不可過高，一般不會超過20nmol/L。要求線性化的連線產物， DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。在用大質粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連線反應中，DNA濃度還應降低，甚至是DNA的總濃 度低至幾個nmol/L。另據研究，T4 DNA連線酶對DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連線時DNA濃度不應低於1nmol/L。即應具有2nmol/L的末端濃度。
1、 連線緩衝液的影響：大體上緩衝液含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的範圍在7.4-7.8，較多 用7.8，目的是提供合適酸鹼度的連線體系；10mmol/L的MgCl2，作用是啟用酶反應；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L， 作用是維持還原性環境，穩定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩衝液不同的是 連線酶緩衝液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現多用1mmol/L，是酶反應所必需的。 2、 pH的影響：一般將緩衝液的pH調節到7.4-7.8，較多用7.8。有實驗表明，若把pH為7.5-8.0時的酶活力定為100%，那麼體系偏鹼（pH為8.3）時僅為全部活力的65%；當體系偏酸（PH為6.9）時僅為全部活力的40%。 3、 ATP濃度的影響：連線緩衝液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發現，ATP的最適濃度為0.5-1mmol /L，過濃會抑制反應。例如，5mmol/L的ATP會完全抑制平末端連線，黏端的連線也有10%被抑制；還有報道，當ATP的濃度為0.1mmol/L 時，去磷酸載體的自環比例最大。由於ATP極易分解，所以當連線反應失敗時，除了DNA與酶的問題外，還應考慮ATP的因素。含有ATP的緩衝液應於 -20℃儲存，溶化取用後立即放回。連線緩衝液體積較大時最好分小管貯存，防止反覆凍融引起ATP分解。與限制酶緩衝液不同的是，含ATP的連線緩衝液長 期放置後往往失效，所以也可自行配製不含ATP的緩衝液（可長期儲存），臨用時加入新配製的ATP母液。 4、 連線溫度與時間的影響：因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩定，但連線酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經 過綜合考慮後，傳統上將連線溫度定為16℃，時間為4-16h。現經實驗發現，對於一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當好的連線效果，當然如果時間充裕的話，20℃ 60min能使連線反應進行得更完全一些。對於平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發揮。 5、 酶濃度的影響：日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態低10-20倍，連線平末端時酶用量要比連線黏端大10-100倍。進行黏末端連線時需先行稀釋，稀釋液的成分與酶儲存緩衝液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便於隨時取用。 6、 DNA濃度的影響：要求得到環化的有效連線產物， DNA濃度不可過高，一般不會超過20nmol/L。要求線性化的連線產物， DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。在用大質粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連線反應中，DNA濃度還應降低，甚至是DNA的總濃 度低至幾個nmol/L。另據研究，T4 DNA連線酶對DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連線時DNA濃度不應低於1nmol/L。即應具有2nmol/L的末端濃度。