醫學微生物學實驗指導
實驗十一 乙型肝炎抗原抗體檢測
（Assay For Antigens and Antibodies of Hepatitis B Virus）
用RIA和ELISA法檢測病人血清中的HBV抗原抗體是目前臨床上診斷乙型肝炎最常用的檢測方法。主要靠檢測HBsAg、HBcAg、HBeAg及其相應抗體，由於HBcAg在血清中不易檢出，故通常只檢測HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc（俗稱‘兩對半’）。其中HBsAg的檢測最為重要，可發現無症狀攜帶者，是獻血員篩選的必檢指標。這裡介紹ELISA法。
HBV抗原抗體的血清學指標與臨床關係較複雜，必須對幾項指標同時分析，還必須結合臨床及肝功能綜合評價，才有助於臨床診斷和治療。
【目的要求】
瞭解和熟悉乙型肝炎的檢測方法及原理。
【臨床資料】
患者，男，13歲，未婚，於2周前出現厭食症狀，胃口差，怕油膩，伴有乏力和全身不適，曾擬診斷“消化不良”進行治療，未見好轉。病程中患者睡眠差，小便黃，大便無特殊。平素健康良好，預防接種史不詳，半年前曾因車禍致股骨骨折在私人診所進行手術治療，術中輸血200ml。體格檢查：體溫：37.6℃，鞏膜黃，肝腫大有壓痛及叩痛。脾肋腫大。餘正常。
實驗室檢查：血常規：白細胞（WBC）：3.5×109/L，其中淋巴細胞50%；血液生化示：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）：105u/L（連續監測法）天門冬酸氨基轉移酶（AST）：90u/L（連續監測法），血清白蛋白（A）：30g/L，血清球蛋白（G）：40g/L，A/G=0.75；
問題：
最有可能引起該病的病原體是什麼？應進行什麼檢測？
【檢測程式】
取患者血液→ 離心得患者血清標本→ ELISA法檢測乙肝‘兩對半’→ 結果判定→ 發報告。
【原理】
1． 夾心法
（1）雙抗體夾心法：如HBsAg、HBeAg試劑盒。
將抗-HBs（或抗-HBe）聯接（包被）到聚苯乙烯微量反應板上，加入被檢血清標本，若血清中含有HBsAg（或HBeAg），則在微量反應板孔內形成抗原抗體複合物，再加入酶標記的抗-HBs（或抗-HBe）與複合物中的HBsAg（或HBeAg）結合，然後加入底物，酶催化底物顯色，根據顯色的程度進行HBsAg（或HBeAg）的定性或定量判定。
（2）雙抗原夾心法：如抗-HBs試劑盒。
用HBsAg包被微量反應板，加入被檢血清標本，再加入酶標HBsAg，加底物顯色，用以檢測血清中是否有抗-HBs。
（3）競爭法：如抗-HBe試劑盒
將抗-HBe結合於固相載體上，然後同時加入被檢血清標本和中和試劑（含有一定滴度的HBeAg），如果被檢標本中含有抗-HBe則和固相載體上的抗-HBe競爭結合HBeAg，被檢標本中抗-HBe的含量越高，競爭結合的HBeAg越多，而與固相載體上的抗-HBe結合的HBeAg量越少，加入酶標抗-HBe與已經結合到固相載體上的HBeAg量越少，加入底物顯色的顏色越淺；反之，顏色則越深。
（4）競爭抑制法：如抗-HBc試劑盒。
將抗-HBc結合於固相載體上，然後加入HBcAg，形成抗原抗體複合物，再加入被檢血清標本和酶標抗-HBc。被檢血清標本中若無抗-HBc，則酶標抗-HBc與複合物中的HBcAg結合，被檢血清標本中若含有抗-HBc，則被檢血清標本中的抗-HBc與複合物中的HBcAg結合，競爭性地佔去了酶標抗-HBc與複合物中HBcAg結合的機會，是酶標抗-HBc與複合物中HBcAg結合的量減少。加入底物顯色，根據顏色的深淺判定結果。
【材料】
1． 標本：患者血液
2． 試劑盒：乙型肝炎病毒HBsAg檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒抗-HBs檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒HBeAg檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒抗-HBe檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒抗-HBc檢測試劑盒；
3． 其他：微量移液器，吸頭，37℃恆溫箱，洗滌液，吸水紙，離心機等。
注：各試劑盒的反應板上已經包被好相應的抗原或抗體。
【方法】
1． 患者血液離心得待檢血清標本。
2． 開啟試劑盒，取出微量反應板。在微量反應板上依次作好標記HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc各三孔。
3． 在第一排中，依次向HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc孔加入100μl待檢血清標本。
4． 在第二排中，分別依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 1滴陽性對照血清。
5． 在第三排中，分別依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 1滴陰性對照血清。
6． 分別向各孔加入相應的酶結合物1滴，振盪搖勻，置37℃恆溫箱恆溫30分鐘。
7． 取出後用洗滌液洗板5次，每次沖洗後拍幹。
8． 加入底物A、B各1滴，置置37℃恆溫箱恆溫15分鐘。
9． 取出後加終止液1滴。
10．根據顏色判定結果。
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實驗十一 乙型肝炎抗原抗體檢測
（Assay For Antigens and Antibodies of Hepatitis B Virus）
用RIA和ELISA法檢測病人血清中的HBV抗原抗體是目前臨床上診斷乙型肝炎最常用的檢測方法。主要靠檢測HBsAg、HBcAg、HBeAg及其相應抗體，由於HBcAg在血清中不易檢出，故通常只檢測HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc（俗稱‘兩對半’）。其中HBsAg的檢測最為重要，可發現無症狀攜帶者，是獻血員篩選的必檢指標。這裡介紹ELISA法。
HBV抗原抗體的血清學指標與臨床關係較複雜，必須對幾項指標同時分析，還必須結合臨床及肝功能綜合評價，才有助於臨床診斷和治療。
【目的要求】
瞭解和熟悉乙型肝炎的檢測方法及原理。
【臨床資料】
患者，男，13歲，未婚，於2周前出現厭食症狀，胃口差，怕油膩，伴有乏力和全身不適，曾擬診斷“消化不良”進行治療，未見好轉。病程中患者睡眠差，小便黃，大便無特殊。平素健康良好，預防接種史不詳，半年前曾因車禍致股骨骨折在私人診所進行手術治療，術中輸血200ml。體格檢查：體溫：37.6℃，鞏膜黃，肝腫大有壓痛及叩痛。脾肋腫大。餘正常。
實驗室檢查：血常規：白細胞（WBC）：3.5×109/L，其中淋巴細胞50%；血液生化示：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）：105u/L（連續監測法）天門冬酸氨基轉移酶（AST）：90u/L（連續監測法），血清白蛋白（A）：30g/L，血清球蛋白（G）：40g/L，A/G=0.75；
問題：
最有可能引起該病的病原體是什麼？應進行什麼檢測？
【檢測程式】
取患者血液→ 離心得患者血清標本→ ELISA法檢測乙肝‘兩對半’→ 結果判定→ 發報告。
【原理】
1． 夾心法
（1）雙抗體夾心法：如HBsAg、HBeAg試劑盒。
將抗-HBs（或抗-HBe）聯接（包被）到聚苯乙烯微量反應板上，加入被檢血清標本，若血清中含有HBsAg（或HBeAg），則在微量反應板孔內形成抗原抗體複合物，再加入酶標記的抗-HBs（或抗-HBe）與複合物中的HBsAg（或HBeAg）結合，然後加入底物，酶催化底物顯色，根據顯色的程度進行HBsAg（或HBeAg）的定性或定量判定。
（2）雙抗原夾心法：如抗-HBs試劑盒。
用HBsAg包被微量反應板，加入被檢血清標本，再加入酶標HBsAg，加底物顯色，用以檢測血清中是否有抗-HBs。
（3）競爭法：如抗-HBe試劑盒
將抗-HBe結合於固相載體上，然後同時加入被檢血清標本和中和試劑（含有一定滴度的HBeAg），如果被檢標本中含有抗-HBe則和固相載體上的抗-HBe競爭結合HBeAg，被檢標本中抗-HBe的含量越高，競爭結合的HBeAg越多，而與固相載體上的抗-HBe結合的HBeAg量越少，加入酶標抗-HBe與已經結合到固相載體上的HBeAg量越少，加入底物顯色的顏色越淺；反之，顏色則越深。
（4）競爭抑制法：如抗-HBc試劑盒。
將抗-HBc結合於固相載體上，然後加入HBcAg，形成抗原抗體複合物，再加入被檢血清標本和酶標抗-HBc。被檢血清標本中若無抗-HBc，則酶標抗-HBc與複合物中的HBcAg結合，被檢血清標本中若含有抗-HBc，則被檢血清標本中的抗-HBc與複合物中的HBcAg結合，競爭性地佔去了酶標抗-HBc與複合物中HBcAg結合的機會，是酶標抗-HBc與複合物中HBcAg結合的量減少。加入底物顯色，根據顏色的深淺判定結果。
【材料】
1． 標本：患者血液
2． 試劑盒：乙型肝炎病毒HBsAg檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒抗-HBs檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒HBeAg檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒抗-HBe檢測試劑盒；
乙型肝炎病毒抗-HBc檢測試劑盒；
3． 其他：微量移液器，吸頭，37℃恆溫箱，洗滌液，吸水紙，離心機等。
注：各試劑盒的反應板上已經包被好相應的抗原或抗體。
【方法】
1． 患者血液離心得待檢血清標本。
2． 開啟試劑盒，取出微量反應板。在微量反應板上依次作好標記HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc各三孔。
3． 在第一排中，依次向HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc孔加入100μl待檢血清標本。
4． 在第二排中，分別依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 1滴陽性對照血清。
5． 在第三排中，分別依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 1滴陰性對照血清。
6． 分別向各孔加入相應的酶結合物1滴，振盪搖勻，置37℃恆溫箱恆溫30分鐘。
7． 取出後用洗滌液洗板5次，每次沖洗後拍幹。
8． 加入底物A、B各1滴，置置37℃恆溫箱恆溫15分鐘。
9． 取出後加終止液1滴。
10．根據顏色判定結果。