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  • 1 # uotkn25480

    1、所說的PCR應該就是最常規的PCR,以DNA為模板,透過上下游引物,實現DNA的擴增。2、RT-PCR一般情況下是指反轉錄PCR(reverse transcription),儘管有些資料上說實時熒光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也簡稱RT-PCR,但是這是不對的,不推薦。基本操作過程是將所提取的RNA進行反轉錄,然後將所獲得的cDNA作為模板,設計引物進行擴增,是一種檢測基因表達的常用方法。3、實時熒光定量PCR也就是Real-Time PCR,其最大的作用是檢測樣品中的初始DNA濃度。至於三者的關係,RT-PCR和實時定量PCR應該都屬於PCR,在RNA實驗中,這二者都會應用到。例如你要比較2個組織中的某基因的表達差異,首先你要提取2個組織的總RNA,然後透過RT-PCR檢測該基因是否在2個組織中有表達,然後透過實時定量PCR測定該基因在2個組織中的表達量是否具有顯著性差異。擴充套件資料:PCR原理DNA的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子複製。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此,透過溫度變化控制DNA的變性和復性,加入設計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複製。但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次迴圈都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個迴圈加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,並逐步應用於臨床。PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈,重複迴圈變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留複製鏈”,而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

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