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    轉基因技術,即將一段DNA轉入受體細胞的技術,據此,可以分成以下幾種情況:

    環狀DNA轉入原核或低等真核細胞,這些細胞可以維持環狀DNA的存在,稱之為轉化;線狀或環狀DNA轉入高等真核細胞,這些細胞不可以維持線狀或環狀DNA的存在,在短時間表達後這些DNA將被降解,稱之為瞬時轉化;線狀或環狀DNA轉入高等真核細胞,這些細胞可以將轉入的DNA整合到自己的DNA或染色體上,形成穩定的遺傳株系,稱之為穩定轉化。轉基因技術通常指的是第三種情況,一般的受體細胞指的是真核微生物、動物、植物;第一種情況實際上在自然界經常發生,所謂的抗藥菌、超級細菌就是因為第一種情況的發生而是抗藥基因在種群中快速傳播;科學家經常藉助自然界其他生物可以進行第三種轉化的能力來進行轉基因。

    利用轉基因技術,可以獲得具有自然界沒有的形狀組合的“新物種”,以滿足人類的需要,由於供體DNA序列的不同及插入受體的部位不同,轉基因技術大概可以產生以下幾種不同的結果:

    供體DNA序列不同:

    DNA分為非編碼區和編碼區,編碼區即為轉錄產生RNA的區域,非編碼區為不轉錄產生RNA的區域,那麼,不轉錄產生RNA的區域是幹什麼用的呢?

    啟動子、終止子等順式調控元件:這些DNA序列的作用是提供蛋白質結合的位點或利用本身的結構使鄰近基因的表達發生變化,比如,RNA聚合酶需要透過TATAbox、GCATbox等啟動子結構才可以結合到DNA上起始轉錄,而部分細菌的終止子可以利用本身的髮卡結構終止基因的轉錄。轉座子:這是一種可以在基因組DNA之中“旋轉跳躍”的元件,我們所知的很多花色、玉米米粒顏色等突變的始作俑者都是它;部分轉座子起源於逆轉錄病毒。重複序列:這些序列由不同程度重複的序列組成,通常,著絲點、端粒都有這樣的結構。

    那麼問題來了,我們轉入的是一段什麼樣的序列呢?

    不同的序列元件需要不同的環境才能發揮功能,在這裡題主說到的應該是指編碼區的DNA,編碼區可以編碼的RNA無非就是mRNA、tRNA、rRNA以及一些其他的microRNA、lncRNA、snRNA等等,其中最典型的就是mRNA。

    mRNA的表達涉及到轉錄出hnRNA隨後的內含子剪接過程,此處是我們遇到的第一個限制:

    在不同的物種中剪接的方式是不一樣的,因此:

    由於內含子剪接的問題,目的基因可能無法在受體中正確剪接;

    當然,我們還有另外一種策略,即利用cDNA來進行PCR擴增基因獲得基因的mRNA序列。

    mRNA的結構我們可以透過NCBI 的 Genbank資料庫來了解一下:

    這是人的COMT基因:

    其中的exon表示外顯子,CDS表示編碼蛋白質的區域,並不是所有的mRNA序列均為CDS,在mRNA的兩端還有兩段UTR序列,即非翻譯區,起到調節mRNA翻譯的功能。

    假使我們有了完成的mRNA反轉錄來的DNA序列,那麼此處就又出現了兩個限制:

    由於不同物種的翻譯起始識別區域不同,目的基因UTR中的翻譯起始點等元件可能不被受體所接受(真核生物以5"-帽子為識別部位,原核生物則是SD序列);由於不同物種的翻譯機器與密碼子偏好性不同,目的基因在受體中可能無法被正確翻譯。

    我們經常需要將來自於真核生物的基因放到原核生物大腸桿菌中進行表達,通常的做法是將目的基因的CDS(直接對應編碼蛋白質的序列)序列按照受體菌株的密碼子偏好性進行最佳化,之後接在受體菌株自身的啟動子及UTR序列之後,即可實現成功表達。

    這個時候,假設我們的目的基因經過了一系列的考研,成功被翻譯成為了多肽,那麼此時還有最後一道考驗等待著它;

    多肽被翻譯後,還需要經過正確的摺疊和和修飾才可以發揮正確的生物學功能;

    蛋白質的摺疊可以參考我近期的一個回答:

    喵大俠:蛋白質的空間結構是隻由氨基酸性質(如親水性等)決定,還是透過核糖體內質網使其有空間結構?

    修飾系統則很複雜,大致包括內質網和高爾基體上的糖基化、細胞質基質中的磷酸化、N端氨基酸的切割、連線脂肪酸鏈的醯基化等,因此:

    想要正確表達蛋白質,還需要考慮多肽鏈的摺疊和修飾過程能否在受體中正確完成。

    受體被插入的位置不同:

    首先,值得注意的是,無論插入的是哪種DNA,都必須要考慮位置效應的問題:

    由於外源DNA插入染色質的位置而導致的基因沉默或異常表達,稱為位置效應。

    也就是說,我們匯入的DNA可能會插入一個染色質固縮或被甲基化的位點,導致基因沉默(也就是無法表達)。

    其次,當我們插入的DNA接入了另一個基因的內部而不是基因之間的間隙,那將導致以下幾種情況,結合前面所說的基因結構,你一定可以明白下面的幾條:

    插入了基因的上游調節元件,如啟動子,或者是插入了編碼區的UTR但並沒有破壞基因本身的調節元件:目的基因的表達和被插入基因的表達均會發生變化,被插入基因極有可能被沉默,目的基因可能會增強表達。插入了基因的內含子區域:如果不影響內含子的剪接,則會形成重疊基因,由於轉錄時的空間位阻,大機率兩個基因的表達均被抑制;如果影響了內含子的剪接,則會破壞被插入基因。如果插入的是編碼區,則可能形成融合蛋白;如果插入的是啟動子,則可能會形成一個不完整的蛋白。插入了基因的下游調節元件:通常情況下影響不會很大,但也有可能改變被插入基因的表達效率,降低或者提高(當插入的區域含有增強子時);插入了基因的CDS區域:這種結果大機率導致移碼突變,插入的編碼區和被插入基因均被破壞,如果恰巧沒有發生移碼突變,那也大機率破壞被插入基因。

    因此,對於非編碼區的插入,我們應當充分考慮以上兩點後,再來考慮其本身生物學功能的問題:想必你所能想到的調節元件插入一個基因的不同位置的情況已經很全面了,在此給出一個圖,大家可以自行想象在不同位置插入增強或抑制或絕緣元件的後果:

    插入外源非編碼區DNA只能改變內源基因的表達或啟用原先無啟動子的蛋白質編碼區;絕緣子的作用是阻隔兩側元件對彼此的影響;應答元件可以對某種訊號做出應答,改變基因的轉錄水平;

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