多種DNA聚合酶在DNA複製過程中扮演不同的角色。在大腸桿菌中,DNA Pol III是主要負責DNA複製的聚合酶。它在複製分支上組裝成複製複合體,具有極高的持續性,在整個複製週期中保持完整。相反,DNA Pol I是負責用DNA替換RNA引物的酶。 DNA Pol I除了具有聚合酶活性外,還具有5"至3"外切核酸酶活性,並利用其外切核酸酶活性降解RNA引物。 Pol I在DNA複製中的主要功能是建立許多短DNA片段,而不是產生非常長的片段。在真核生物中,Pol α有助於啟動複製,因為它與引物酶形成複合物。Pol ε和Pol δ負責前導鏈的合成。Pol δ還負責引物的去除,而Pol ε也參與複製期間DNA的修復。
DNA複製是指DNA雙鏈在細胞分裂以前的分裂間期S期進行的複製過程,複製的結果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈,每條雙鏈都與原來的雙鏈一樣。這個過程透過邊解旋邊複製和半保留複製機制得以順利完成。
DNA複製過程
DNA複製主要包括引發、延伸、終止三個階段[1] 。以原核生物DNA複製過程予以簡要說明。
引發
DNA複製始於基因組中的特定位置(複製起點),即啟動蛋白的靶標位點[2] 。啟動蛋白識別“富含AT”(富含腺嘌呤和胸腺嘧啶鹼基)的序列,因為AT鹼基對具有兩個氫鍵(而不是CG對中形成的三個),因此更易於DNA雙鏈的分離。 一旦複製起點被識別,啟動蛋白就會募集其他蛋白質一起形成前複製複合物,從而解開雙鏈DNA,形成複製叉。複製叉的形成是多種蛋白質及酶參與的較複雜的過程。這些酶包括單鏈DNA結合蛋白(single—stranded DNA binding protein,ssbDNA蛋白)和DNA解鏈酶(DNA helicase)。ssbDNA蛋白是較牢固結合在單鏈DNA上的蛋白質,作用是保證解旋酶解開的單鏈在複製完成前能保持單鏈結構,以四聚體的形式存在於複製叉處,等待單鏈複製後才脫下來,重新迴圈。因此,ssbDNA蛋白僅保持單鏈的存在,不起解旋作用。 DNA解鏈酶能透過水解ATP獲得能量以解開雙鏈DNA。
DNA解鏈過程 DNA在複製前不僅是雙螺旋而且處於超螺旋狀態,而超螺旋狀態的存在是解鏈前的必須結構狀態,參與解鏈的除解鏈酶外還有一些特定蛋白質,如大腸桿菌中的Dna蛋白等。一旦DNA區域性雙鏈解開,就必須有ssbDNA蛋白以穩定解開的單鏈,保證此區域性不會恢復成雙鏈。兩條單鏈DNA複製的引發過程有所差異,但是不論是前導鏈還是後隨鏈,都需要一段RNA引物用於開始子鏈DNA的合成。因此前導鏈與後隨鏈的差別在於前者從複製起始點開始按5’—3’持續的合成下去,不形成岡崎片段,後者則隨著複製叉的出現,不斷合成長約2—3kb的岡崎片段。
延伸
多種DNA聚合酶在DNA複製過程中扮演不同的角色。在大腸桿菌中,DNA Pol III是主要負責DNA複製的聚合酶。它在複製分支上組裝成複製複合體,具有極高的持續性,在整個複製週期中保持完整。相反,DNA Pol I是負責用DNA替換RNA引物的酶。 DNA Pol I除了具有聚合酶活性外,還具有5"至3"外切核酸酶活性,並利用其外切核酸酶活性降解RNA引物。 Pol I在DNA複製中的主要功能是建立許多短DNA片段,而不是產生非常長的片段。在真核生物中,Pol α有助於啟動複製,因為它與引物酶形成複合物。Pol ε和Pol δ負責前導鏈的合成。Pol δ還負責引物的去除,而Pol ε也參與複製期間DNA的修復。
在複製叉附近,形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發體和螺旋構成的類似核糖體大小的複合體,稱為DNA複製體(replisome)。複製體在DNA前導鏈模板和滯後鏈模板上移動時便合成了連續的DNA前導鏈和由許多岡崎片段組成的滯後鏈。在DNA合成延伸過程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。當岡崎片段形成後,DNA聚合酶Ⅰ透過其5"→3"外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物,同時,利用後一個岡崎片段作為引物由5"→3"合成DNA。最後兩個岡崎片段由DNA連線酶將其接起來,形成完整的DNA滯後鏈。
終止
真核生物在染色體的多個點開始DNA複製,因此複製叉在染色體的許多點處相遇並終止。由於真核生物具有線性染色體,DNA複製無法到達染色體的最末端。由於這個問題,在染色體末端的DNA在每個複製週期中都會丟失。端粒是接近末端的重複DNA區域,有助於防止由於這種基因丟失。端粒縮短是體細胞中的正常過程,它縮短了子DNA染色體的端粒。因此,在DNA丟失阻止進一步分裂之前,細胞只能分裂一定次數。 在生殖細胞中,端粒酶延伸端粒區域的重複序列以防止降解。
DNA複製的終止發生在特定的基因位點,即複製終止位點。該位點的終止位點序列被與該序列結合的阻止DNA複製的蛋白質識別並結合,阻止了複製叉前進,複製終止。細菌物的DNA複製末端位點結合蛋白又稱Ter蛋白。
因為細菌具有環狀染色體,所以當兩個複製叉在親本染色體的另一端彼此相遇時複製終止發生。大腸桿菌透過使用終止序列來調節該過程,當該序列被Tus蛋白結合時,終止序列僅允許複製叉一個方向的通行。結果,複製叉總是在染色體的終止區域內相遇,導致複製終止。
DNA複製的特點
半保留複製:DNA在複製時,以親代DNA的每一個單鏈作模板,合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA,每個子代DNA中都含有一個親代DNA鏈,這種現象稱為DNA的半保留複製。DNA以半保留方式進行復制,是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的實驗所證明。
有一定的複製起始點:DNA在複製時,需在特定的位點起始,這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段,即複製起始點(複製子)。在原核生物中,複製起始點通常為一個,而在真核生物中則為多個。
需要引物(primer):DNA聚合酶必須以一段具有3"端自由羥基(3"-OH)的RNA作為引物,才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小,在原核生物中通常為50~100個核苷酸,而在真核生物中約為10個核苷酸。
雙向複製:DNA複製時,以複製起始點為中心,向兩個方向進行復制。但在低等生物中,也可進行單向複製。
半不連續複製:由於DNA聚合酶只能以5"→3"方向聚合子代DNA鏈,因此兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。以3"→5"方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在聚合時基本上是連續進行的,這一條鏈被稱為領頭鏈(前導)(leading strand)。而以5"→3"方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在聚合時則是不連續的,這條鏈被稱為隨從鏈(滯後鏈)(lagging strand)。DNA在複製時,由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。岡崎片段的大小,在原核生物中約為1000~2000個核苷酸,而在真核生物中約為100個核苷酸。