1. 蛋白與膜的結合原理
蛋白與膜的結合原理， 已知的結合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等，確切的結合原理並不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：
1）首先兩者靠靜電作用力結合，然後靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。
2）首先兩者靠疏水作用結合，然後靠靜電作用來維持長時間結合。
兩條假說，都表明其結合過程分為兩步，首先結合和後面長時間結合。由於結合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗。
2. 膜對結合的影響
1）膜孔徑
有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜，但是請注意這隻僅僅限於同一廠家的產品，如果是不同廠家的產品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關係，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的引數為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。
另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那麼金標複合物透過T線的時間也就越長，反應也就越充分。
綜合以上兩點，結論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，也就是假陽性越高.所以要按照試驗結果挑選適合實際專案的膜，找到合適的平衡點。
2）不同廠家的膜差異
3. 生物原料，緩衝溶液的試劑和配方
1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這裡只做略述。
首先，單克隆抗體與膜的結合優於多克隆抗體，主要時由於多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了最佳化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結合到固相材料上。
2）緩衝液
大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方，包括緩衝液，封閉液等等處理溶液配方。
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應體系需要不同的配方來支援， 而不同機構的反應體系又有差異。想獲”魚”先學”漁”.。為了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。
緩衝液的構成一般是：PBS（或其他緩衝體系）+作用物質（針對某一特定問題）+PH調整. 我在參考過以前的各種資料後，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據自己的需要新增作用物質，原來的很多需要新增的作用物質，由於膜製造技術的改進已經不再需要。
推薦的緩衝體係為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩衝體系對多種抗原抗體都有良好的適應性。
作用物質的情況大致羅列如下：
少量NACL，減少訊號強度，消假陽。
有機醇（甲醇，異丙醇等），潤溼膜，減少膜帶有的靜電，利於結合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。
表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現象，也可增色。
糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。
調PH到某個位置，可以消假陽。
4. 點樣環境
環境溼度對點膜過程非常重要。最佳溼度一般在45-65%。溼度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現散點，導致測試會出現疏水斑。溼度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜溼度的均一性，一般在點樣前把膜放到該溼度條件下平衡一段時間。
5. 點樣儀器與膜面情況的關係
目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優於劃膜式，進口劃膜式優於中國產劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質為軟脆，劃管會在其表面留下印痕.進口的劃膜機由於使用的材料和控制系統較好，所以留下的劃痕較輕，而中國產儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。 劃痕容易對層析的金標複合物形成阻力，導致假陽性。 同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線（鬼線），而跑板結束後鬼線消失的奇怪現象。
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標複合物透過T線位置時速度變慢，反應時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當乾燥時線條邊緣的乾燥速度高於中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以乾燥後抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發現線條出現兩端紅，中間淡的現象，就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質來解決。
8. 點膜前後的封閉作用
從供應商處購買回的膜基本上都是已經最佳化處理好的，直接點膜就可使用.然而我們還是經常會遇到關於封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什麼問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內，必然擾亂了膜內正常的物質分佈。由此引發了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以透過其他辦法來解決，封閉必然是下測。
我經常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產品的穩定性造成影響，具體的影響程度要透過穩定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產出的膜一般含有5-10%的水分。關於膜的老化機理，有個理論支援，不過爭議比較大。理論認為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發，使膜變得疏水，帶電荷並變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過幹或過溼都不利。在這種儲存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據具體試驗情況來判斷了。有些膜由於生產工藝的問題，使用後靈敏度會在一段時間內發生變化，遇到這種問題，就需要在點膜後放置一段時間，待穩定後方可進入除錯生產。
硝酸纖維素膜NC膜
規格: 15X20cm
孔徑: 0.45μm
儲存: 5-15℃密封儲存,保質期一年
產品簡介: 本品外觀潔白，膜正面呈光澤，與水接觸應立即浸潤，不能立即浸潤老者視為失活，不能點樣，膜面有花斑或有粉性結構皆視為次品。用於轉移電泳，宜選孔經0.22或0.45，以保證膜的強度，並減少穿透損失，硝纖膜過份乾燥時脆,溼時有彈性，操作時室內應保持中常溫度，避免過份乾燥，防止發脆，本品靜電吸附膜的親水性好，滲濾時間適中，蛋白吸附力強，轉膜的蛋白集中而不擴散，顯色的靈敏度和特異性高，背景低。
1. 蛋白與膜的結合原理
蛋白與膜的結合原理， 已知的結合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等，確切的結合原理並不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：
1）首先兩者靠靜電作用力結合，然後靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。
2）首先兩者靠疏水作用結合，然後靠靜電作用來維持長時間結合。
兩條假說，都表明其結合過程分為兩步，首先結合和後面長時間結合。由於結合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗。
2. 膜對結合的影響
1）膜孔徑
有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜，但是請注意這隻僅僅限於同一廠家的產品，如果是不同廠家的產品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關係，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的引數為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。
另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那麼金標複合物透過T線的時間也就越長，反應也就越充分。
綜合以上兩點，結論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，也就是假陽性越高.所以要按照試驗結果挑選適合實際專案的膜，找到合適的平衡點。
2）不同廠家的膜差異
3. 生物原料，緩衝溶液的試劑和配方
1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這裡只做略述。
首先，單克隆抗體與膜的結合優於多克隆抗體，主要時由於多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了最佳化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結合到固相材料上。
2）緩衝液
大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方，包括緩衝液，封閉液等等處理溶液配方。
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應體系需要不同的配方來支援， 而不同機構的反應體系又有差異。想獲”魚”先學”漁”.。為了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。
緩衝液的構成一般是：PBS（或其他緩衝體系）+作用物質（針對某一特定問題）+PH調整. 我在參考過以前的各種資料後，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據自己的需要新增作用物質，原來的很多需要新增的作用物質，由於膜製造技術的改進已經不再需要。
推薦的緩衝體係為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩衝體系對多種抗原抗體都有良好的適應性。
作用物質的情況大致羅列如下：
少量NACL，減少訊號強度，消假陽。
有機醇（甲醇，異丙醇等），潤溼膜，減少膜帶有的靜電，利於結合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。
表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現象，也可增色。
糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。
調PH到某個位置，可以消假陽。
4. 點樣環境
環境溼度對點膜過程非常重要。最佳溼度一般在45-65%。溼度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現散點，導致測試會出現疏水斑。溼度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜溼度的均一性，一般在點樣前把膜放到該溼度條件下平衡一段時間。
5. 點樣儀器與膜面情況的關係
目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優於劃膜式，進口劃膜式優於中國產劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質為軟脆，劃管會在其表面留下印痕.進口的劃膜機由於使用的材料和控制系統較好，所以留下的劃痕較輕，而中國產儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。 劃痕容易對層析的金標複合物形成阻力，導致假陽性。 同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線（鬼線），而跑板結束後鬼線消失的奇怪現象。
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標複合物透過T線位置時速度變慢，反應時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當乾燥時線條邊緣的乾燥速度高於中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以乾燥後抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發現線條出現兩端紅，中間淡的現象，就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質來解決。
8. 點膜前後的封閉作用
從供應商處購買回的膜基本上都是已經最佳化處理好的，直接點膜就可使用.然而我們還是經常會遇到關於封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什麼問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內，必然擾亂了膜內正常的物質分佈。由此引發了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以透過其他辦法來解決，封閉必然是下測。
我經常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產品的穩定性造成影響，具體的影響程度要透過穩定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產出的膜一般含有5-10%的水分。關於膜的老化機理，有個理論支援，不過爭議比較大。理論認為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發，使膜變得疏水，帶電荷並變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過幹或過溼都不利。在這種儲存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據具體試驗情況來判斷了。有些膜由於生產工藝的問題，使用後靈敏度會在一段時間內發生變化，遇到這種問題，就需要在點膜後放置一段時間，待穩定後方可進入除錯生產。
硝酸纖維素膜NC膜
規格: 15X20cm
孔徑: 0.45μm
儲存: 5-15℃密封儲存,保質期一年
產品簡介: 本品外觀潔白，膜正面呈光澤，與水接觸應立即浸潤，不能立即浸潤老者視為失活，不能點樣，膜面有花斑或有粉性結構皆視為次品。用於轉移電泳，宜選孔經0.22或0.45，以保證膜的強度，並減少穿透損失，硝纖膜過份乾燥時脆,溼時有彈性，操作時室內應保持中常溫度，避免過份乾燥，防止發脆，本品靜電吸附膜的親水性好，滲濾時間適中，蛋白吸附力強，轉膜的蛋白集中而不擴散，顯色的靈敏度和特異性高，背景低。