細胞核移植，就是將一個細胞核用顯微注射的方法放進另一個細胞裡去。前者為供體，可以是胚胎的幹細胞核，也可以是體細胞的核。受體大多是動物的卵子。因卵子的體積較大，操作容易，而且透過發育，可以把特徵表現出來，因此細胞核移植技術，主要是用來研究胚胎髮育過程中，細胞核和細胞質的功能，以及二者間的相互關係；探討有關遺傳，發育和細胞分化等方面的一些基本理論問題。該技術已有幾十年的歷史。1952年，Briggs 和King在兩棲類動物中首次獲得核移植成功，使得發育生物學上的幾個根本問題得到了解答。Gurdon用非洲爪蟾的上皮細胞等體細胞的核作移植，確立了已經分化的細胞核可以正常發育的事實。中國胚胎學家童第周先生等在魚類細胞核移植方面做了許多工作。他們在1976年前後首次獲得的鯉鯽移核魚，不僅有理論意義，而且也為魚類育種開闢了一條新的途徑。 哺乳動物的細胞核移植也早已引起關注，因哺乳類受精卵極小，體外培養和細胞核移植技術難度大，因此直到1981年IIImensee和Hoppe才首次報道獲得成功。Mcgrath和Solter 在1983年發表了用核移植技術與細胞融合相配合的方法，能將90%以上的移核卵培養到胚泡期。經過胚胎移植，均可獲得一定比例的核移植小鼠。 本實驗以蛙和哺乳動物為實驗材料介紹細胞核移植技術。 實驗技術 一、蛙的細胞核移植（圖17.1） （一）受體卵的準備 1.去膜： 經人工催產使蛙卵成熟。擠出成熟的蛙卵，逐個去掉卵膠膜，接著把卵整齊地排列在高溫滅菌過的培養皿內，使其粘於皿底。並使卵子動物極朝上，以便進行激動和挑核。然後加入適量的手術液，每次可在一個培養皿內排列卵25-40個。 2. 激動： 蛙卵在未受精前仍處於第二次成熟分裂的中期。為了使卵子完成第二次成熟分裂，排出第二極體，在雙目解剖鏡下，用一枚消毒過的玻璃針在動物極靠近赤道的地區淺刺一下，目的是代替自然受精時精子入卵的過程。由於針刺動作比精子入卵的速度快得多，所以針刺手術要輕緩。激動後的卵子，10-15分鐘後產生第二極體。在解剖鏡下可見動物極附近有一折光的圓形小球，此即第二極體。 3. 挑核： 當第二極體出現時，用一枚消毒過的玻璃針在極體處斜插入卵子表層，然後迅速提起針尖，由於卵黃膜的破裂，極體下的卵核隨著一小部分細胞質流出卵外，形成一個卵外球，一般極體排出15分鐘以後會逐漸消失。這樣挑核應在極體出先後10分鐘內完成，否則核將沉入卵子中心，去核手術不易成功。 4. 再去膜： 挑核後經過10分鐘左右，待傷口基本癒合時，用兩把磨的很尖的鐘表鑷子，漸次剝去卵外膠膜，直至餘下一層受精膜為止。操作步驟如下：在雙目解剖鏡下，先將一把尖頭鑷子的一邊尖端從卵子附著皿底的膠膜處小心而快速地插入到最內層膠膜，然後夾緊膠膜，把卵固定住，再用另一把鑷子從卵子另一側夾緊膠膜，向上向後把膠膜掀去，若用兩把鑷子左右對拉，則易損傷卵子，且使卵質變位，影響胚胎髮育。 剝膜後的卵子移到盛有手術液的培養皿中置於玻璃板上，供注核用。 （二）供體細胞的分離 取囊胚或早期原腸胚的外胚層作為供體細胞。先在濾紙上除去膠膜，然後移入皿底塗有一層瓊脂的並盛有分離液的培養皿中，用兩把鑷子剝去胚胎外餘下的各層膠膜，切下外胚層，吸去不用的胚胎部分。一個很小的組織塊放在分離液內數分鐘，並輕輕搖動，細胞便可自行分散。如不分散，可用毛細吸管輕輕吹打。 分散後的胚胎細胞用毛細吸管移到盛有手術液的培養皿中，置於塗有瓊脂的小載玻片上，作為移植時的供體細胞。 （三）核移植 1. 顯微注射器的準備： 每次手術前應向顯微注射器的整個管道系統灌入手術液或雙蒸水，檢查管道的各銜接處有否漏氣。管內只要有一極小的氣泡，注射器的調節就失靈。同時應注意選擇彈簧上彈性較靈敏的部位以便操作準確（圖17.2，17.3，17.4）。 2. 微型吸管的製備： 吸管最好用軟質玻璃管。製作前，先將玻管用洗液洗淨，再用蒸餾水徹底將酸洗去。這樣可使拉出的微吸管內部潔淨，不致影響細胞核的吸入和射出。將玻管拉成口徑1mm的細管，然後在微火焰上，再拉成微吸管，管徑在10-20微米之間（圖17.5，17.6）。 3. 吸細胞核： 吸核的方法不是將微吸管頭刺入供體細胞內吸取細胞核，而是利用顯微操縱檯透過輕輕地來回轉動千分尺外徑，將一個細胞慢慢地吸入微吸管。必須注意微吸管的內徑要比細胞小，這樣能使被吸入的細胞由於吸力的作用而破裂，結果可以依靠目測，將細胞核和包在它周圍的一部分細胞質一起吸入管內，避免細胞核直接與液體接觸，以免受損。還應調節使供體細胞儘量靠近管口，避免注核時帶入較多的手術液。 4. 注核： 將吸有供體細胞核的微吸管在離動物極45度左右的地方刺入動物半球的中心，再稍微向上提一下管口，然後輕輕地推動微量注射器，把管內的細胞核連同周圍的細胞質慢慢地注入卵內。如果注射速度太快，注入卵內的壓力過大，則會使卵子破裂，導致實驗失敗。 一般從首次去膠膜到注完15個左右的核，需2-2.5小時，時間過長，將會影響移核卵的發育。 5. 培養觀察： 移核後的卵子轉入1/10 Holtfreter 液中，置25℃恆溫箱中培養。及時觀察卵子的發育並做好記錄。 6. 用同批卵按常規人工授精的方法獲得受精卵，置培養皿中在同等溫度條件下培養，以便與移核卵作對比觀察。 二、哺乳動物的細胞核移植 1. 取卵： 取卵的方法與實驗十六相同。 2. 去核卵的製作： 用白色小鼠的受精卵作受體，在有相差干涉裝置的顯微鏡下，將預先備好的移核針管頭端，藉助顯微操作器刺入受精卵的透明帶，讓針頭僅穿過透明帶而不刺破卵子的質膜。再用針口對準雄核，隔著質膜將其吸入針管內。然後將針口對準雌核，以同樣的方法將雌、雄原核吸至針管前端，隨即慢慢拔出針管。此時可見到卵子質膜彈性很大，在管口與透明帶之間質膜被拉成細絲，然後斷開，形成只有細胞質的去核卵和在針管內有兩個原核和少量細胞質，外有質膜包裹的兩個部分。該去核卵即作受體用（圖17.7）。 3. 細胞核移植： 用同法將作供體的黑小鼠受精卵的雌、雄原核吸入針管內，然後吸入少許仙台病毒（Inactivatied Sendai Viras），再將上述針管移至去核卵，讓管口穿過透明帶原有的小孔進入卵周隙，此時輕輕轉動注射器，使外有質膜包裹的雌、雄原核和仙台病毒一起進入受體卵的透明帶與質膜之間的卵周隙，然後把針管緩緩抽出即可（圖17.8）。如繼續觀察，能見到在病毒的作用下，移入細胞核所帶的質膜與去核的質膜接觸處，質膜慢慢溶化消失，雌、雄原核進入受體卵的融合過程。該移核卵子，實際是核質雜交。如果操作成功，在二氧化碳培養箱內培養， 90%以上的卵子可發育至胚泡期，經過胚胎移 植可獲得核移植的核質雜交小鼠。 在核移植的全過程中，每一步驟均需嚴格操作，儘量減少對細胞膜、質和核的損傷，所用的器皿也需嚴格消毒，防止汙染，以提高各個步驟的成活率。 實驗材料 1.實驗材料： 蛙受精卵，蛙囊胚晚期或原腸早期胚胎，昆明白小鼠，黑小鼠（C57BL―6）. 2.實驗儀器： 顯微操作器、顯微注射器、拉針器、酒精噴燈、虹膜剪刀、尖頭鐘錶鑷、 內徑0.5cm，0.3cm玻璃管、1mm玻璃毛細管、玻璃針、培養皿、彎頭吸管、毛細吸管、微吸管、溫箱、雙目解剖鏡、顯微鏡。 3.實驗藥品： 手術液：即 Holtfreter液，需煮沸消毒 分離液： NaCl 0.35g KCl 0.005g 雙蒸水 100ml 待以上混合液煮沸消毒冷卻後加入 EDTA(乙二胺四乙酸) 18.6mg NaHCO3 0.02g Ringer液 70%酒精 2%瓊脂
細胞核移植，就是將一個細胞核用顯微注射的方法放進另一個細胞裡去。前者為供體，可以是胚胎的幹細胞核，也可以是體細胞的核。受體大多是動物的卵子。因卵子的體積較大，操作容易，而且透過發育，可以把特徵表現出來，因此細胞核移植技術，主要是用來研究胚胎髮育過程中，細胞核和細胞質的功能，以及二者間的相互關係；探討有關遺傳，發育和細胞分化等方面的一些基本理論問題。該技術已有幾十年的歷史。1952年，Briggs 和King在兩棲類動物中首次獲得核移植成功，使得發育生物學上的幾個根本問題得到了解答。Gurdon用非洲爪蟾的上皮細胞等體細胞的核作移植，確立了已經分化的細胞核可以正常發育的事實。中國胚胎學家童第周先生等在魚類細胞核移植方面做了許多工作。他們在1976年前後首次獲得的鯉鯽移核魚，不僅有理論意義，而且也為魚類育種開闢了一條新的途徑。 哺乳動物的細胞核移植也早已引起關注，因哺乳類受精卵極小，體外培養和細胞核移植技術難度大，因此直到1981年IIImensee和Hoppe才首次報道獲得成功。Mcgrath和Solter 在1983年發表了用核移植技術與細胞融合相配合的方法，能將90%以上的移核卵培養到胚泡期。經過胚胎移植，均可獲得一定比例的核移植小鼠。 本實驗以蛙和哺乳動物為實驗材料介紹細胞核移植技術。 實驗技術 一、蛙的細胞核移植（圖17.1） （一）受體卵的準備 1.去膜： 經人工催產使蛙卵成熟。擠出成熟的蛙卵，逐個去掉卵膠膜，接著把卵整齊地排列在高溫滅菌過的培養皿內，使其粘於皿底。並使卵子動物極朝上，以便進行激動和挑核。然後加入適量的手術液，每次可在一個培養皿內排列卵25-40個。 2. 激動： 蛙卵在未受精前仍處於第二次成熟分裂的中期。為了使卵子完成第二次成熟分裂，排出第二極體，在雙目解剖鏡下，用一枚消毒過的玻璃針在動物極靠近赤道的地區淺刺一下，目的是代替自然受精時精子入卵的過程。由於針刺動作比精子入卵的速度快得多，所以針刺手術要輕緩。激動後的卵子，10-15分鐘後產生第二極體。在解剖鏡下可見動物極附近有一折光的圓形小球，此即第二極體。 3. 挑核： 當第二極體出現時，用一枚消毒過的玻璃針在極體處斜插入卵子表層，然後迅速提起針尖，由於卵黃膜的破裂，極體下的卵核隨著一小部分細胞質流出卵外，形成一個卵外球，一般極體排出15分鐘以後會逐漸消失。這樣挑核應在極體出先後10分鐘內完成，否則核將沉入卵子中心，去核手術不易成功。 4. 再去膜： 挑核後經過10分鐘左右，待傷口基本癒合時，用兩把磨的很尖的鐘表鑷子，漸次剝去卵外膠膜，直至餘下一層受精膜為止。操作步驟如下：在雙目解剖鏡下，先將一把尖頭鑷子的一邊尖端從卵子附著皿底的膠膜處小心而快速地插入到最內層膠膜，然後夾緊膠膜，把卵固定住，再用另一把鑷子從卵子另一側夾緊膠膜，向上向後把膠膜掀去，若用兩把鑷子左右對拉，則易損傷卵子，且使卵質變位，影響胚胎髮育。 剝膜後的卵子移到盛有手術液的培養皿中置於玻璃板上，供注核用。 （二）供體細胞的分離 取囊胚或早期原腸胚的外胚層作為供體細胞。先在濾紙上除去膠膜，然後移入皿底塗有一層瓊脂的並盛有分離液的培養皿中，用兩把鑷子剝去胚胎外餘下的各層膠膜，切下外胚層，吸去不用的胚胎部分。一個很小的組織塊放在分離液內數分鐘，並輕輕搖動，細胞便可自行分散。如不分散，可用毛細吸管輕輕吹打。 分散後的胚胎細胞用毛細吸管移到盛有手術液的培養皿中，置於塗有瓊脂的小載玻片上，作為移植時的供體細胞。 （三）核移植 1. 顯微注射器的準備： 每次手術前應向顯微注射器的整個管道系統灌入手術液或雙蒸水，檢查管道的各銜接處有否漏氣。管內只要有一極小的氣泡，注射器的調節就失靈。同時應注意選擇彈簧上彈性較靈敏的部位以便操作準確（圖17.2，17.3，17.4）。 2. 微型吸管的製備： 吸管最好用軟質玻璃管。製作前，先將玻管用洗液洗淨，再用蒸餾水徹底將酸洗去。這樣可使拉出的微吸管內部潔淨，不致影響細胞核的吸入和射出。將玻管拉成口徑1mm的細管，然後在微火焰上，再拉成微吸管，管徑在10-20微米之間（圖17.5，17.6）。 3. 吸細胞核： 吸核的方法不是將微吸管頭刺入供體細胞內吸取細胞核，而是利用顯微操縱檯透過輕輕地來回轉動千分尺外徑，將一個細胞慢慢地吸入微吸管。必須注意微吸管的內徑要比細胞小，這樣能使被吸入的細胞由於吸力的作用而破裂，結果可以依靠目測，將細胞核和包在它周圍的一部分細胞質一起吸入管內，避免細胞核直接與液體接觸，以免受損。還應調節使供體細胞儘量靠近管口，避免注核時帶入較多的手術液。 4. 注核： 將吸有供體細胞核的微吸管在離動物極45度左右的地方刺入動物半球的中心，再稍微向上提一下管口，然後輕輕地推動微量注射器，把管內的細胞核連同周圍的細胞質慢慢地注入卵內。如果注射速度太快，注入卵內的壓力過大，則會使卵子破裂，導致實驗失敗。 一般從首次去膠膜到注完15個左右的核，需2-2.5小時，時間過長，將會影響移核卵的發育。 5. 培養觀察： 移核後的卵子轉入1/10 Holtfreter 液中，置25℃恆溫箱中培養。及時觀察卵子的發育並做好記錄。 6. 用同批卵按常規人工授精的方法獲得受精卵，置培養皿中在同等溫度條件下培養，以便與移核卵作對比觀察。 二、哺乳動物的細胞核移植 1. 取卵： 取卵的方法與實驗十六相同。 2. 去核卵的製作： 用白色小鼠的受精卵作受體，在有相差干涉裝置的顯微鏡下，將預先備好的移核針管頭端，藉助顯微操作器刺入受精卵的透明帶，讓針頭僅穿過透明帶而不刺破卵子的質膜。再用針口對準雄核，隔著質膜將其吸入針管內。然後將針口對準雌核，以同樣的方法將雌、雄原核吸至針管前端，隨即慢慢拔出針管。此時可見到卵子質膜彈性很大，在管口與透明帶之間質膜被拉成細絲，然後斷開，形成只有細胞質的去核卵和在針管內有兩個原核和少量細胞質，外有質膜包裹的兩個部分。該去核卵即作受體用（圖17.7）。 3. 細胞核移植： 用同法將作供體的黑小鼠受精卵的雌、雄原核吸入針管內，然後吸入少許仙台病毒（Inactivatied Sendai Viras），再將上述針管移至去核卵，讓管口穿過透明帶原有的小孔進入卵周隙，此時輕輕轉動注射器，使外有質膜包裹的雌、雄原核和仙台病毒一起進入受體卵的透明帶與質膜之間的卵周隙，然後把針管緩緩抽出即可（圖17.8）。如繼續觀察，能見到在病毒的作用下，移入細胞核所帶的質膜與去核的質膜接觸處，質膜慢慢溶化消失，雌、雄原核進入受體卵的融合過程。該移核卵子，實際是核質雜交。如果操作成功，在二氧化碳培養箱內培養， 90%以上的卵子可發育至胚泡期，經過胚胎移 植可獲得核移植的核質雜交小鼠。 在核移植的全過程中，每一步驟均需嚴格操作，儘量減少對細胞膜、質和核的損傷，所用的器皿也需嚴格消毒，防止汙染，以提高各個步驟的成活率。 實驗材料 1.實驗材料： 蛙受精卵，蛙囊胚晚期或原腸早期胚胎，昆明白小鼠，黑小鼠（C57BL―6）. 2.實驗儀器： 顯微操作器、顯微注射器、拉針器、酒精噴燈、虹膜剪刀、尖頭鐘錶鑷、 內徑0.5cm，0.3cm玻璃管、1mm玻璃毛細管、玻璃針、培養皿、彎頭吸管、毛細吸管、微吸管、溫箱、雙目解剖鏡、顯微鏡。 3.實驗藥品： 手術液：即 Holtfreter液，需煮沸消毒 分離液： NaCl 0.35g KCl 0.005g 雙蒸水 100ml 待以上混合液煮沸消毒冷卻後加入 EDTA(乙二胺四乙酸) 18.6mg NaHCO3 0.02g Ringer液 70%酒精 2%瓊脂