單克隆抗體製備過程中經過兩次篩選
單克隆抗體製備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。
第一次篩選的原理與方法：細胞融合後，雜交瘤細胞的選擇性培養是第一次篩選的關鍵。普遍採用的HAT選擇性培養液是在普通的動物細胞培養液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依據是細胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一條途徑是應急途徑或補救途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養液中，未融合的效應B細胞和兩個效應B細胞融合的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養液中增殖的能力，一般10d左右會死亡。對於骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而言，由於通常採用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶缺陷型（HGPRT）細胞，因此自身沒有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤細胞與效應B細胞相互融合形成的雜交瘤細胞，既具有效應B細胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細胞在體外培養液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養液中選擇性存活下來，並不斷增殖。
第二次篩選的原理和方法：在實際免疫過程中，由於採用連續注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機體形成相對應的一種效應B淋巴細胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應B淋巴細胞的特異性是不同的，經HAT培養液篩選的雜交瘤細胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細胞群中篩選出能產生針對某一預定抗原快定簇的特異性雜交瘤細胞。通常採用有限稀釋克隆細胞的方法，將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養板上，使每一孔含一個或幾個雜交瘤細胞（理論上30%的孔中細胞數為0時，才能保證有些孔中是單個細胞），再由這些單細胞克隆生長，最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養。因此，單克隆抗體製備過程中，兩次篩選的原理和方法是不相同的。 單克隆抗體製備的基本原理與過程 原理： B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續分化增殖下去，因此產生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術即稱為單克隆抗體技術。 過程 1）免疫脾細胞的製備 製備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決於所用抗原的性質。免疫方法同一般血清的製備，也可採用脾內直接免疫法。 2）骨髓瘤細胞的培養與篩選 在融合前，骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選，防止細胞發生突變恢復HGPRT的活性（恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活）。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細胞處於對數生長期。 3）細胞融合的關鍵: 1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。 2融合試驗最大的失敗原因是汙染，融合成功的關鍵是提供一個乾淨的環境，以及適宜的無菌操作技術。 4）陽性克隆的篩選 應儘早進行。通常在融合後10天作第一次檢測，過早容易出現假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質，以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡便，RIA法最準確。陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。 5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體。克隆化應儘早進行並反覆篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的，有丟失染色體的傾向。反覆克隆化後可獲得穩定的雜交瘤細胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀釋法。 （1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細胞，然後進行單細胞培養。這種方法操作複雜，效率低，故不常用。 （2）有限稀釋法：將對數生長期的雜交瘤細胞用培養液作一定的稀釋後，按每孔1個細胞接種在培養皿中，細胞增值後成為單克隆細胞系。第一次克隆化時加一定量的飼養細胞。由於第一次克隆化生長的細胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩定的單克隆細胞株需經2～3次的再克隆才成。應該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細胞都應冷凍儲存，以便重複檢查，避免丟失有意義的細胞。 （3）軟瓊脂法：將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然後與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養的目的。但此法不如有限稀釋法好。 （4）熒光鐳射細胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標記雜交瘤細胞，然後根據抗原與雜交瘤細胞結合的特異性選出細胞，並進行單細胞培養。 6）細胞的凍存與復甦 7）大規模單克隆抗體的製備 選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養時間延長，發生汙染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養法，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器裝置，一般應用無血清培養基，以利於單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍採用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一週後將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一週後即有明顯的腹水產生，每隻小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便於抗體的純化。 摘要 在單克隆抗體製備中兩次提到篩選問題，對於兩次篩選的方法和目的始終是一些人的困惑，那麼兩次篩選 的目的和方法到底是什麼。 單克隆抗體製備過程中兩次提到了篩選，對於兩次篩選中的目的和方法許多人也存在疑惑，那麼到底是如何篩選的呢？現總結如下： 第一次篩選: 首先在（效應）B淋巴細胞和骨髓瘤細胞進行雜交時可能出現的情況應該先弄清楚， （一）可能的情況有： 1 （效應）B淋巴細胞和（效應）B淋巴細胞的融合 2 （效應）B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合（即雜交瘤細胞） 3 骨髓瘤細胞和骨髓瘤細胞的融合（即瘤瘤細胞） 4 單個骨髓瘤細胞 5 單個（效應）B淋巴細胞 （二）篩選的目的————獲得雜交瘤細胞 （三）篩選的方法 用選擇性培養基來完成，即HAT培養基。含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻斷DNA合成的主要途徑。主要途徑阻斷後，依靠應急途徑即在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA，缺少其中一種，DNA合成不能發生。用於雜交的骨髓瘤細胞系均由經有毒藥物誘導而成選擇產生的代謝缺陷型細胞，細胞內均無TK或HGPRT，所以單個或融合骨髓瘤細胞在HAT培養液中將死亡。B細胞雖然有HGPRT和TK，但在體外通常培養條件下，尤其是在單個細胞環境下難於長期存活和增殖傳代。因此只有雜交瘤細胞才能在HAT培養液中生長繁殖。 所以透過以上方法可以選擇出雜交瘤細胞，但雖然都是雜交瘤細胞，但可能是同一抗原的不同抗原決定基刺激產生的。所以產生抗體是不純的。如果不進一步提純，這樣得到的是多克隆抗體。所以就有了第二次篩選。 第二次篩選 要想獲得單克隆抗體，所以必須得到由一個細胞分裂而成的一個細胞群， 由這樣的細胞群產生的抗體才是真正意義的單克隆抗體。 (一) 篩選的目的 篩選只針對某一種特定的抗原決定簇產生抗體的雜交瘤細胞，即得到由一個細胞分裂而成的一個細胞群並且能產生所需抗體 （二）篩選的方法 1、分離單個細胞置入多孔培養板的每個孔中培養 2、檢測每孔細胞是否產生所注射抗原的抗體（即教材插圖中提到的選出能產生特定抗體的細胞群）所以篩選的條件是兩層意思：單個細胞單孔培養保證每個孔中的細胞在產生抗體時是針對同一抗原的同一抗原決定簇產生的的，但每個孔中細胞卻不一定都能產生抗體，把那些不產生抗體的細胞淘汰，對能分泌針對抗原某一決定簇抗體的陽性細胞選擇下來繼續克隆，從而保證大量的生產所需抗體。 3、對選擇下來的細胞進行克隆方法有兩種：一種可以在體外培養；一種可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可從中提取所需要的單克隆抗體。
單克隆抗體製備過程中經過兩次篩選
單克隆抗體製備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。
第一次篩選的原理與方法：細胞融合後，雜交瘤細胞的選擇性培養是第一次篩選的關鍵。普遍採用的HAT選擇性培養液是在普通的動物細胞培養液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依據是細胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一條途徑是應急途徑或補救途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養液中，未融合的效應B細胞和兩個效應B細胞融合的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養液中增殖的能力，一般10d左右會死亡。對於骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而言，由於通常採用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶缺陷型（HGPRT）細胞，因此自身沒有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤細胞與效應B細胞相互融合形成的雜交瘤細胞，既具有效應B細胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細胞在體外培養液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養液中選擇性存活下來，並不斷增殖。
第二次篩選的原理和方法：在實際免疫過程中，由於採用連續注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機體形成相對應的一種效應B淋巴細胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應B淋巴細胞的特異性是不同的，經HAT培養液篩選的雜交瘤細胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細胞群中篩選出能產生針對某一預定抗原快定簇的特異性雜交瘤細胞。通常採用有限稀釋克隆細胞的方法，將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養板上，使每一孔含一個或幾個雜交瘤細胞（理論上30%的孔中細胞數為0時，才能保證有些孔中是單個細胞），再由這些單細胞克隆生長，最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養。因此，單克隆抗體製備過程中，兩次篩選的原理和方法是不相同的。 單克隆抗體製備的基本原理與過程 原理： B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續分化增殖下去，因此產生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術即稱為單克隆抗體技術。 過程 1）免疫脾細胞的製備 製備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決於所用抗原的性質。免疫方法同一般血清的製備，也可採用脾內直接免疫法。 2）骨髓瘤細胞的培養與篩選 在融合前，骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選，防止細胞發生突變恢復HGPRT的活性（恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活）。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細胞處於對數生長期。 3）細胞融合的關鍵: 1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。 2融合試驗最大的失敗原因是汙染，融合成功的關鍵是提供一個乾淨的環境，以及適宜的無菌操作技術。 4）陽性克隆的篩選 應儘早進行。通常在融合後10天作第一次檢測，過早容易出現假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質，以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡便，RIA法最準確。陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。 5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體。克隆化應儘早進行並反覆篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的，有丟失染色體的傾向。反覆克隆化後可獲得穩定的雜交瘤細胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀釋法。 （1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細胞，然後進行單細胞培養。這種方法操作複雜，效率低，故不常用。 （2）有限稀釋法：將對數生長期的雜交瘤細胞用培養液作一定的稀釋後，按每孔1個細胞接種在培養皿中，細胞增值後成為單克隆細胞系。第一次克隆化時加一定量的飼養細胞。由於第一次克隆化生長的細胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩定的單克隆細胞株需經2～3次的再克隆才成。應該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細胞都應冷凍儲存，以便重複檢查，避免丟失有意義的細胞。 （3）軟瓊脂法：將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然後與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養的目的。但此法不如有限稀釋法好。 （4）熒光鐳射細胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標記雜交瘤細胞，然後根據抗原與雜交瘤細胞結合的特異性選出細胞，並進行單細胞培養。 6）細胞的凍存與復甦 7）大規模單克隆抗體的製備 選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養時間延長，發生汙染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養法，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器裝置，一般應用無血清培養基，以利於單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍採用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一週後將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一週後即有明顯的腹水產生，每隻小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便於抗體的純化。 摘要 在單克隆抗體製備中兩次提到篩選問題，對於兩次篩選的方法和目的始終是一些人的困惑，那麼兩次篩選 的目的和方法到底是什麼。 單克隆抗體製備過程中兩次提到了篩選，對於兩次篩選中的目的和方法許多人也存在疑惑，那麼到底是如何篩選的呢？現總結如下： 第一次篩選: 首先在（效應）B淋巴細胞和骨髓瘤細胞進行雜交時可能出現的情況應該先弄清楚， （一）可能的情況有： 1 （效應）B淋巴細胞和（效應）B淋巴細胞的融合 2 （效應）B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合（即雜交瘤細胞） 3 骨髓瘤細胞和骨髓瘤細胞的融合（即瘤瘤細胞） 4 單個骨髓瘤細胞 5 單個（效應）B淋巴細胞 （二）篩選的目的————獲得雜交瘤細胞 （三）篩選的方法 用選擇性培養基來完成，即HAT培養基。含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻斷DNA合成的主要途徑。主要途徑阻斷後，依靠應急途徑即在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA，缺少其中一種，DNA合成不能發生。用於雜交的骨髓瘤細胞系均由經有毒藥物誘導而成選擇產生的代謝缺陷型細胞，細胞內均無TK或HGPRT，所以單個或融合骨髓瘤細胞在HAT培養液中將死亡。B細胞雖然有HGPRT和TK，但在體外通常培養條件下，尤其是在單個細胞環境下難於長期存活和增殖傳代。因此只有雜交瘤細胞才能在HAT培養液中生長繁殖。 所以透過以上方法可以選擇出雜交瘤細胞，但雖然都是雜交瘤細胞，但可能是同一抗原的不同抗原決定基刺激產生的。所以產生抗體是不純的。如果不進一步提純，這樣得到的是多克隆抗體。所以就有了第二次篩選。 第二次篩選 要想獲得單克隆抗體，所以必須得到由一個細胞分裂而成的一個細胞群， 由這樣的細胞群產生的抗體才是真正意義的單克隆抗體。 (一) 篩選的目的 篩選只針對某一種特定的抗原決定簇產生抗體的雜交瘤細胞，即得到由一個細胞分裂而成的一個細胞群並且能產生所需抗體 （二）篩選的方法 1、分離單個細胞置入多孔培養板的每個孔中培養 2、檢測每孔細胞是否產生所注射抗原的抗體（即教材插圖中提到的選出能產生特定抗體的細胞群）所以篩選的條件是兩層意思：單個細胞單孔培養保證每個孔中的細胞在產生抗體時是針對同一抗原的同一抗原決定簇產生的的，但每個孔中細胞卻不一定都能產生抗體，把那些不產生抗體的細胞淘汰，對能分泌針對抗原某一決定簇抗體的陽性細胞選擇下來繼續克隆，從而保證大量的生產所需抗體。 3、對選擇下來的細胞進行克隆方法有兩種：一種可以在體外培養；一種可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可從中提取所需要的單克隆抗體。