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  • 1 # faamy7099

    是的,要做PCR。首先你要提出細菌的DNA。方法如下:1、液體培養及保種:從斜面上挑取菌苔於液體培養基中放搖床上震盪(轉速160r/min)培養16小時。吸取菌液於1.5ml的經過滅菌的EP管中,再加甘油(30-40%)進行保種。(-80攝氏度保藏2年)2、提取DNA(CTAB法): (1)取1.5ml菌液於1. 5ml離心管中,12000r/min離心2min,棄上清。 (2)向沉澱物中加入350ul雙蒸水,重新懸浮沉澱。 (3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),溶菌酶3ul,混勻,於50℃溫育1h。 (4)加入50ul 5mol/L NaCl溶液,充分混勻,再加入50ul CTAB/NaCl溶液,混合後再65℃溫育30min。 (6)冷卻後加入等體積的酚(沉澱蛋白質):氯仿:異戊醇(增強酚的作用)(25:24:1),小心上下顛倒混勻,12000r/min離心5min,將上清液轉移到新的EP管,重複此步驟2-3次,直至分層介面無白色沉澱。 (7)加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1),小心顛倒混勻,12000r/min離心5min將上清液轉移到新的EP管。(純化作用) (8)加入0.6倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉澱下來,12000r/min離心15min棄上清。 (9)向離心管中加入75%乙醇,12000r/min離心5min洗滌DNA沉澱,小心棄上清,重複洗滌1次,棄上清將離心管倒置於吸水紙上,晾乾。 (10)加入50ul(雙蒸水)/ TE Buffer溶解DNA於4℃儲存。 (11)電泳檢測6、PCR擴增:(細菌的通用引物為27F和1492R)將提取得到的DNA進行PCR擴增,電泳檢測擴增得到的16S rDNA(如果菌類分明,條帶清晰,PCR原液可直接送去測序,雙向測通,得到測序序列後到NCBI的BLAST頁面比對,得出鑑定結果)7、酶切帶型分型確定操作單元:將擴增產物用HhaI和HaeIII兩種限制性內切酶進行酶切,電泳檢測酶切產物,酶切帶型相同的分為一個操作單元。 8、連線轉化:從每一個操作單元中選取一株菌的16S rDNA進行連線實驗。將連線產物轉入感受態細胞中,將感受態細胞塗布於含有Amp的平板上,倒置培養12-16h。 9、克隆子挑選及PCR鑑定:從上一步的平板上挑取單菌落於含有Amp的液體培養基中震盪培養12h,以培養液為模板直接進行PCR擴增鑑定(1000-2000bp)。將含有目的片段的克隆子菌液低溫儲存。 10、測序:將含有目的片段的克隆子菌液送去測序。11、序列拼接:運用DNAMAN軟體對測序得到的序列進行拼接。12、建樹:對拼接得到的序列用Blast進行比對,最後將比對得到的所有序列運用MEGA6建立系統發育樹。

  • 2 # pzyyo24296

    細菌傳統鑑定是指形態觀察、生理生化測定等,複雜,但較準確。分子生物學常用的是16SrDNA鑑定,這個只能堅定到屬,要堅定到種還是得做生理生化實驗,這是經典的分類方法,比較方便快捷的是先16S鑑定大概確定下,然後用生理生化確定微生物種的分類。

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