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  • 1 # 使用者86050544185

    Ames試驗的常規方法有斑點試驗和平板摻入試驗。

    1.菌株鑑定 用於測試的菌株,需經基因型和生物學性狀鑑定,符合要求才能投入使用。

    目前推薦使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鑑定前先進行增菌培養。為鑑定結果可靠,需同時培養野生型TV菌株,作為測試菌基因型之對照。增菌培養用牛肉膏蛋白腖液體培養基,接種後於37℃,100r/min振盪培養12h左右,細菌生長相為對數期末,含菌數應為1×109個/ml~2×109個/ml。

    鑑定專案:

    (1)脂多糖屏障丟失(rfa)用接種環或一端撓起的接種針以無菌操作術取各菌株的增菌培養液,在營養瓊脂平板上分別劃平行線,然後用滅菌尖頭鑷夾取滅菌濾紙條,浸溼結晶紫溶液,貼放在平板上與各接種平行線垂直相交。蓋好皿蓋後倒置於37t溫箱,培養24h後觀察結果。

    (2)R因子 劃線接種,貼放濾紙條及培養等均同上,唯濾紙條浸溼的藥液不同,為氨苄青黴素鈉溶液。TA102除pKM101外,還有pAQ1,載有抗四環素的基因,故另用濾紙條浸溼四環素溶液後貼放於劃線接種的平板上。

    (3)紫外線損傷修復缺陷(△uvrB)在營養瓊脂平板上按上述方法劃線接種後,一半接種線用黑玻璃遮蓋,另一半暴露於紫外光下8sec,然後蓋好皿蓋並用黑紙包裹平皿,防止可見光修復作用。培養同上。

    (4)自發回變 預先製備底平板;向滅菌並在水浴內保溫45℃的上層軟瓊脂中注入0.1ml菌液;混勻後傾於底平板上並鋪平。平皿倒置於37℃溫箱培養48h。

    (5)回變特性——診斷性試驗 上層軟瓊脂中除菌液外,還注入已知陽性物之溶液,需活化系統者並加入S9mix,餘同上。

    組氨酸營養缺陷型由自發回變即可知。

    2.斑點試驗 吸取測試菌增菌培養後的菌液0.1ml,注入融化並保溫45℃左右的上層軟瓊脂中,需S9活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix,立即混勻,傾於底平板上,鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣,紙片浸溼受試物溶液,或直接取固態受試物,貼放於上層培養基的表面。同時做溶劑對照和陽性對照,分別貼放於平板上相應位置。平皿倒置於37℃溫箱培養48h。在紙片外圍長出密集菌落圈,為陽性;菌落散佈,密度與自發回變相似,為陰性。

    3.平板摻入試驗 將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中,需代謝活化的再加0.3ml-0.4ml S9mix,混勻後迅速傾於底平板上鋪平冷凝。同時做陰性和陽性對照,每種處理做3個平行。試樣通常設4個~5個劑量。選擇劑量範圍開始應大些,有陽性或可疑陽性結果時,再在較窄的劑量範圍內確定劑量反應關係。培養同上。同一劑量各皿回變菌落均數與各陰性對照皿自發回變菌落均數之比,為致變比(MR)。MR值≥2,且有劑量-反應關係,背景正常,則判為致突變陽性。

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