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  • 1 # 使用者5933125843701

    DNA指紋技術原理:

    一般要透過以下幾點來完成:

    1、將送檢的各種生物學檢樣,如毛髮、血痕、精斑、人體組織或白骨等,把其中所含的DNA 提取出來。

    2、選用與探針配對的限制性核酸內切酶,在長鏈DNA 位置上加以切割,使分子量很大的DNA 長鏈切短成許多長度不同的小片段。

    3、在膠板尺寸較長的凝膠電泳儀中,對酶解完全後的DNA 片段進行電泳,各酶切片段就會按其長度大小在電場中進行分離。

    4、先用鹼性溶液使凝膠板中分離開的雙鏈DNA 片段變性為單鏈片段,然後將凝膠板夾在尼龍膜中,使這些單鏈DNA

    片段印潰(blot-ting),轉移並永久性地固定在尼龍膜上。

    5、讓放射性DNA探針與尼龍膜上的單鏈DNA片段進行分子雜交。

    6、用放射性膠片與尼龍薄膜疊放,尼龍膜上的放射性探針便會發出X 射線使膠片曝光,從而使雜交有探針的長度不同的DNA片段位置顯影在膠片上。這樣的特徵

    DNA片段條狀圖譜,便是所謂的DNA指紋。

    1 DNA指紋圖的建立及發展

    近百年來的研究認為,任何遺傳分析都是以遺傳標誌為基礎的,而任何一個遺傳標誌的價值又在於其變異 性(即多型性)的大小。有關遺傳多型性的研究對促進人類學、遺傳學、免疫學以及法醫學的發展, 以及對闡明某些疾病的發病機理乃至協助診斷等方面都起了十分重要的作用。但以往的研究都是利用各種外部表現型、生理缺陷型、同工酶、多型蛋白等作為遺傳標誌,用間接分析來推論相應的遺傳基因。

    70年代末,限制性內切酶和重組體DNA技術的出現以及分子生物學的飛速發展,使人們對遺傳標誌的研究轉向DNA分子本身。由於各種遺傳資訊都蘊藏在DNA分子上,生物個體間的差異在本質上是DNA分子的差異,因此DNA被認為是最可靠的遺傳標誌。某些DNA序列的差異可透過限制性酶切片段長度的改變來反映,此即限制性片段長度多型性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP),其產生是由於點突變、DNA重排、插入或缺失引起的〔1〕。隨著對RFLP研究的深入,人們發現了基因組中最有變異性的一類序列——高變異DNA序列,使DNA遺傳標誌的發展和應用得到了一次飛躍。

    1980年,Wyman和White描述了第一個多等位性的具有高度多型性的人類DNA標誌。不久,在胰島素基因(Insulingene)的5′端區域、致癌基因(C-Haras I Oncogene)的3′端分別發現了相同的高度可變的標誌(hypervariable marker)。在α-球蛋白(α-globin)基因群周圍還發現了其它三個標誌〔2〕。1982年,Bell等〔3〕證實:這些高度多型性區域串聯著重複的短序列單位,重複單位數目的差異導致了這種高度的可變性,由於這些結構特徵,人們稱這些區域為小衛星(minisatellite)或高度可變區域(hypervariable)或可變數目的串聯重複(variable number of tandem repeats)。

    1985年,Jeffreys 等〔4〕用肌紅蛋白基因第一內含子中的串聯重複序列(重複單位含33bp)作探針,從人的基因文庫中篩選出8個含有串聯重複序列(小衛星)的重組克隆。序列分析表明,這8個小衛星重複單位的長度和序列不完全相同,但都有相同的核心序列(core sequence)即GGCCAGGA/GGG。他們先後用兩個多核心小衛星(poly coreminisate

    -llite)33.6和33.15探針進行southern雜交,在低嚴謹條件下雜交得到了包含10多條帶的雜交圖譜,不同個體雜交圖譜上帶的位置就象人的指紋一樣千差萬別,Jeffrey稱之為DNA指紋(DNA fingerprint)〔5〕,又名遺傳指紋(genetic fingerprint)。

    RFLP DNA指紋分析技術由於方法繁雜、週期長、實驗條件高等缺陷而無法大範圍推廣。1990年,Williams等〔6〕首次報道了AP-PCR技術,Welsh和McCelland〔7〕亦獨立地進行了這方面的工作,從而使DNA指紋技術應用更加廣泛。AP-PCR技術是採用隨意設計的1個或2個引物,對模板DNA進行PCR擴增,一般先是在低嚴格條件,即在高Mg2+濃度(大於傳統PCR Mg2+濃度1.5mmol/L)、較低退火溫度(36℃~50℃)下進行1~6個迴圈的PCR擴增,隨後在嚴格條件下進行PCR擴增,產物經2%瓊脂糖凝膠電泳或6%變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離,可得到DNA指紋圖譜。其基本原理是:在低嚴格復性條件下,引物與模板DNA非完全互補序列形成錯配,錯配引物在DNA聚合酶作用下沿模板鏈延伸,合成新鏈,當在一定距離內模板DNA另一單鏈也發生引物錯配時,即可對兩錯配引物間的DNA進行擴增。但是此種錯配並非隨機發生,引物和模板間,特別是在引物3′端必須存在一定的互補序列,即可產生不同的擴增片段或組合,透過DNA指紋圖譜,可得到配對DNA樣品中的差異片段,用於克隆、測序、染色體定位和基因片段的生物學功能研究。

    中國楊建廠等〔8〕利用PCR的原理成功地建立了一種全新的DNA指紋檢測技術,稱之為隨機引物PCR人DNA指紋檢測技術(arbitrarily primed PCR human DNA fingerprinting,APHDP),此外還開發出處理DNA指紋資料應用軟體,應用於個人識別、遺傳素質與疾病的相關特徵研究等。

    2 DNA指紋技術所用的探針

    自DNA指紋技術建立以來,這一技術迅速在動植物的進化關係、親緣關係分析以及法醫學方面得到廣泛應用。也正是由於DNA指紋技術在核酸分析中顯示出了強大的生命力,因而許多學者圍繞此技術所用的探針作了大量的工作,除Jeffrey等〔5〕的探針外,用人工化學合成或從生物組織中提取後再擴增的辦法生產出了一批高水平的探針。迄今,在DNA指紋技術中所用的探針大概有probe33.15、33.6〔5〕、bacteriophage MB〔9〕、pig repetitire clone p83、PGB 725、poly(GT) containing 18.1、(GTG)5/(CAC)5〔10,11〕、(CAC/TA)4及(GT)12等。同時,在探針的標誌上也有了很大的發展,根據它們的結構可大致分為小衛星探針和簡單重複序列探針,簡單重複序列包括微衛星探針(microsatellite probe)和寡聚核苷酸探針。小衛星探針的核心序列為33bp,常定位在人常染色體前的末端(proterminal)區域,微衛星探針則在10~20bp之間,而寡聚核苷酸探針在10bp以下,普遍散佈在人類整條染色體上,或者在基因間區域或者位於內含子內。

    1988年,中國伍新堯等〔12〕根據DNA指紋是人基因組中重複序列的RFLP的原理和人與鼠的髓鞘鹼性蛋白(MBP)基因cDNA同源序列性高於90%的事實,選用鼠MBP cDNA3′端的一段序列(非表達區高度重序列,與人基因組中該類重複序列幾乎完全同源),長度為0.81kb的片段作探針,檢測用HaeⅢ酶解的人DNA限制性片段(RF),在人群中可分出22條譜帶,受檢 的30例無血緣關係的個體之間沒有兩個人的譜帶是完全相同的,顯示這一方法的高度個體特異性,這是國內首次用自已的力量找到DNA指紋的探針。

    3 DNA指紋的應用3.1 法醫學方面 同以往的血型測定法相比,DNA指紋技術在法醫學領域上具有無可比擬的優越性。已成為鑑定犯罪、親子鑑定和確定個體間親緣關係的工具〔5,13〕。隨後,國內學者李伯齡〔14〕、姜先華〔15〕、伍新堯等〔12〕也先後對此項技術進行了研究,並應用於實際案件的鑑定中,解決了過去無法解決的疑難案例,如微量血痕、部分腐敗的碎屍塊的個人認定等。

    3.2 在動植物科學中的應用

    3.2.1 生物種群學研究 利用DNA指紋圖可以估算連鎖不平衡,比較等位基因的頻率,還能估計不同個體之間的重組率,在種群學研究上有助於建立某一個體在種群中的地位和關係,特別是對真菌的種群研究,有很多真菌可以透過有性和無性的方式繁殖,但是何時以何種方式繁殖,程度如何,並不清楚,而利用DNA指紋圖就能區分以有性和無性方式產生的後代,並能確定某一區域真菌的自然分佈〔1,16〕。

    3.2.2 測定物種之間的遺傳距離、物種分類鑑定 Jeffreys等〔5〕認為在一個群體的不同成員間複製數的串聯重複序列(VNTR)由於多型性程度高,在遺傳分析中尤其適合作為多型性標誌,簡單重複的不穩定性可導致VNTR長度的迅速變化,根據家族中或育種群體中VNTR的分離重組頻率,可以測定出遺傳距離,可用統計學公式確定個體間的親緣關係:D=2Nab/(Na+Nb),,D值越大,親緣關係越近,遺傳距離就越小;D值越小,親緣關係越遠,遺傳距離就越大。為此,運用DNA指紋技術可檢測不同物種、同種及同種不同個體的親緣關係,用於物種分類鑑定,也可用於雜交後代親本決定,雜交後代群體分開,檢測近等基因系(或同類系)種的多型性,並對檢測基因進行定位。Welsh等〔7〕對布氏疏螺旋體菌株的DNA指紋進行分析,發現這種lyme病的病原菌實際上是由三個不同的種群組成。羅超權等〔12〕運用AP-PCR鑑定弓形蟲蟲株,在國內開創了運用DNA指紋技術作生物分類的先例。

    3.3 在流行病學方面的運用 由於DNA指紋具有以下幾個特點:①能反映基因組的變異性;②具有高度的變異性;③具有簡單的穩定的遺傳性;④DNA指紋譜具有體細胞穩定性。所以,它同一般的流行病學方法相比較而言,具有無比的優越性,使其成為流行病調查的一種有效工具。Jan DA等〔17〕,Denise Chevrel-Dellagi等〔18〕運用IS6110序列作探針對結核病分支桿菌株進行DNA指紋分析,調查國際間結核病的種型、分析流行情況,改進了控制結核病的方法。而ZhenHua Yang等〔19〕從67個病人中分離出結核病分支桿菌株進行DNA指紋分析,發現分離到PTBN12型時易查明流行環節,從而為快速進行疾病控制提供了一個有力證據。在中國,童笑梅等〔20〕採用隨機擴增多型DNA指紋圖技術對醫院內感染的14例新生兒進行病原流行病學分析,發現患兒體內攜帶的與醫務人員鼻中攜帶的華納葡萄球菌菌株的DNA指紋圖完全一致,從而證明此次感染的病原菌為華納葡萄球菌,傳染源是攜帶病菌的醫務人員。郭永建等〔21〕在6個月內對121名產科新生兒中的30名檢出的31株銅綠假單胞菌進行RAPD指紋圖譜分析和血清學分型,結果表明,銅綠假單胞菌在產科新生兒中暴發流行,0∶6/R∶1型為暴發流行性菌株,對醫院感染病原菌分型、精確確定傳染源、阻斷傳播途徑、控制和預防醫院感染具有重要的指導意義。

    3.4 疾病診斷及治療 鑑於DNA指紋所具有的上述特點,故DNA指紋廣泛應用於一些疾病的診斷及治療。Morral〔22〕等發現CF基因9號外顯子側翼含有一小衛星區,且此等位基因2.6帶常與△F508連鎖,相伴率為50.6%、41.6%,△F508是最主要的致病突變,可疑患者電泳圖只要發現2.6等位基因,就可對此病進行初步診斷。現已在Wilson病、外周神經纖維瘤、成人多束腎、多巴性肌緊張、Frecbreich共濟失調、Kallmunm綜合徵性連鎖、視網膜病等基因內或旁側發現有高度的小衛星區域,從而可進行基因診斷。Okamoto R〔23〕用DNA指紋法預測慢性粒cell性白血病骨髓移植術後復發,取得了成功。

    3.5 腫瘤的研究 腫瘤是多因素、多階段的變化過程,病因複雜、變化多樣,但歸根到底還是在DNA的變化上。一般說來,癌組織、轉移灶與正常組織或外周血細胞DNA指紋有差別,常見的是某條帶或幾條帶的缺失,某一條或某幾條帶密度降低,或者癌組織中出現新的帶。Thein等〔24〕用33.6和33.15為探針研究患者DNA指紋譜變化,發現胃腸腫瘤患者癌組織DNA指紋譜全有改變,並認為體細胞突 變還有種屬特異性。劉霜等〔25〕應用RAPD(隨機擴增多型性DNA)分析技術對6例肝癌患者的癌組織與非癌組織進行分析,發現所有肝癌組織基因組DNA的RAPD指紋圖譜均存在差異,其中3例配對肝癌基因組中均存在一相同的0.9Kb的隨機擴增片段。楊建廠等〔8〕用APHDFF技術對28例確診為鼻咽癌病人血DNA指紋圖的檢測,發現有3條DNA片段出現的頻率明顯低於健康人群。王黛等〔26〕用LE11.8、MYO和Mb探針,經Southern雜交法檢測12例兒童急性粒cell白血病患者的外周血或骨髓細胞的基因重排,結果發現初始或復發與完全緩解時的DNA指紋圖相比,譜帶有增加或減少,從而認為急性粒細胞白血病患兒的白血病細胞存在基因重排。

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