一、防止RNA酶汙染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下幹烤6hr或更長時間。
2. 塑膠器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用lv 仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被lv 仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去汙劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。
4. 配製的溶液應儘可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。
6. 設定RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。
二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它透過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷複合物：由氧化釩離子和核苷形成的複合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、矽藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質和RNA，因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與一些緩衝液(例如Tri)不能相容。
在所有RNA實驗中，zui關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的汙染。
RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
研究人員造成的汙染 RNA酶zui主要的潛在汙染源是研究人員的手。因此進行RNA實驗時應勤換手套。
但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。
（一）動植物總RNA提取-Trizol法
Trizol法適用於人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA汙染。 RNA可直接用於Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A) 分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末後，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫放置5分鐘，然後以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入lv 仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖盪離心管15秒。
3、取上層水相於一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。
4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液，然後室溫或真空乾燥5-10分鐘，注意不要乾燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然後將RNA溶於水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存於70%乙醇並保存於-70℃。
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，並儘可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉澱的部分一定要捨得不要，要不然會有蛋白質汙染，影響比值。
2、加lv 仿前的勻漿液可在-70℃儲存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃儲存一週，-20℃儲存一年。
總mRNA的提取(自己的經驗)
一、 關於Trizol Reagent需要的試劑
1． Chloroform：lv 仿 (分析純)
2． Isoproplyl alcohol：異丙醇(分析純)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇並用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。
4． RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃過夜，並高壓滅菌即得（150℃ 3小時）
5． 一次性塑膠手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 關於Trizol Reagent的使用過程：
1． Homogenization（勻漿）
a. Tissues：組織
每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。
b. Cells Grown in monolayer（單層細胞接毒後出現病變的）
針對JEV細胞總RNA的抽提法：
BHK21細胞長成單層後，接毒0.5-1ml（採用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。出現75%-100%的病變時，以PBS（預冷）沖洗細胞兩次，直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細胞（細胞瓶有兩種常用規格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定，以蓋滿瓶底為度，而不是依據細胞的數量，否則可導致DNA的汙染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮）
（1）組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易汙染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白複合物徹底分離。
（2） 加lv 仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入lv 仿0.2ml），蓋好，劇烈震盪15s，置室溫2-3分鐘。
（3） 4℃離心，10000g×15min，離心後，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-lv 仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當於所加的Trizol試劑量的60%。
（4） 仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉澱RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。
（6） 4℃離心，10000g×10min。RNA沉澱為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。
（7） 棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震盪，充分洗滌沉澱，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣乾燥（或真空乾燥）後，沉澱重懸於無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA，-70℃儲存備用。
（8）抽提出的細胞總RNA乾燥後加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。於0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結果應為：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分離組織10mg（純組織）加800ul Trizol試劑。
（10） 擴增產物的鑑定
DEPC處理方法如下：
1. DEPC處理
（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。
（2）Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR儀來控制溫度和時間的，所以RT是在PCR反應管中作的。
4. 操作過程中要戴一次性手套，並經常換手套。
zui 好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭後，加入1-2ml的0.1轕C水，在滅菌就行了；現在有進口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的
如何消除汙染
機器執行完後，取出PCR產物時不能隨便丟棄，應該用塑膠手套或其他打結包好後丟入垃圾桶。
（1）試劑：mixer儘量分裝，不要原瓶多次取用。
（2）加樣：原則是DNAzui後加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那麼採取的方法是算出總體積後加在一個管子裡面，混合均勻之後再分裝到各個管子裡去，這樣可以有效地避免誤差及汙染。
另外，普通實驗室容易汙染，且汙染程度很高，與跑電泳還有質粒製備提取都在同一個房間裡有比較大的關係，zui容易造成高濃度汙染的就是產物的開蓋和質粒的稀釋。
RNA定量
RNA也zui 好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至於用分光光度計比較不同標本之間就更不準了。
RNA的貯藏，zui主要的是溫度，－20不夠，zui 好－80，液氮zui保險
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度的影響
RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但後來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利於PCR的進行
一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關係，計算的是相對錶達程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對錶達量，不是jue 對錶達量
mRNA的分離與純化中
步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然後冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A )尾處的二級結構，使Poly(A )尾充分暴露，從而提高Poly(A )RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的汙染。所以此步驟不能省略。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3）保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,並且用pH7.0的Tris緩衝液補充到10 ul的總體積，然後密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恆溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中儲存1 h。
時間到了之後，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成後，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶汙染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶汙染。
PCR汙染與對策
PCR擴增產物汙染，這是PCR反應中zui主要zui常見的汙染問題，所以，擴增區的儀器什麼如槍頭等要注意。
還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產物汙染的形式是氣溶膠汙染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及汙染進樣槍的反覆吸樣都可形成氣溶膠而汙染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000複製，因而由其造成的汙染是一個值得特別重視的問題。
1. 標本處理區，包括擴增摸板的製備；
2. PCR擴增區，包括反應液的配製和PCR擴增；
3. 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的製備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本製備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的汙染；
操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dNTP、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的度。
反應液汙染
可採用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30 min後加熱滅活，然後加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道汙染DNA的序列；
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由於UV照射的去汙染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用於檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。
1、提取mRNA時所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1轕C水浸泡。然後烘乾，高壓滅菌，再烘乾。
2、用DEPC水洗過後當然不能用雙蒸水洗了。那你用DEPC處理還有什麼意義呢？還要用雙蒸水洗嗎？
3、玻璃器皿幹烤：180度，8小時或更長時間；小器皿也可以用少許lv 仿處理一下。另外，鐵製品、研砵等也可倒上酒精直接燒。
一、防止RNA酶汙染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下幹烤6hr或更長時間。
2. 塑膠器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用lv 仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被lv 仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去汙劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。
4. 配製的溶液應儘可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。
6. 設定RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。
二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它透過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷複合物：由氧化釩離子和核苷形成的複合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、矽藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質和RNA，因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與一些緩衝液(例如Tri)不能相容。
在所有RNA實驗中，zui關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的汙染。
RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
研究人員造成的汙染 RNA酶zui主要的潛在汙染源是研究人員的手。因此進行RNA實驗時應勤換手套。
但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。
（一）動植物總RNA提取-Trizol法
Trizol法適用於人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA汙染。 RNA可直接用於Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A) 分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末後，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫放置5分鐘，然後以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入lv 仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖盪離心管15秒。
3、取上層水相於一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。
4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液，然後室溫或真空乾燥5-10分鐘，注意不要乾燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然後將RNA溶於水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存於70%乙醇並保存於-70℃。
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，並儘可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉澱的部分一定要捨得不要，要不然會有蛋白質汙染，影響比值。
2、加lv 仿前的勻漿液可在-70℃儲存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃儲存一週，-20℃儲存一年。
總mRNA的提取(自己的經驗)
一、 關於Trizol Reagent需要的試劑
1． Chloroform：lv 仿 (分析純)
2． Isoproplyl alcohol：異丙醇(分析純)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇並用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。
4． RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃過夜，並高壓滅菌即得（150℃ 3小時）
5． 一次性塑膠手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 關於Trizol Reagent的使用過程：
1． Homogenization（勻漿）
a. Tissues：組織
每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。
b. Cells Grown in monolayer（單層細胞接毒後出現病變的）
針對JEV細胞總RNA的抽提法：
BHK21細胞長成單層後，接毒0.5-1ml（採用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。出現75%-100%的病變時，以PBS（預冷）沖洗細胞兩次，直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細胞（細胞瓶有兩種常用規格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定，以蓋滿瓶底為度，而不是依據細胞的數量，否則可導致DNA的汙染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮）
（1）組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易汙染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白複合物徹底分離。
（2） 加lv 仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入lv 仿0.2ml），蓋好，劇烈震盪15s，置室溫2-3分鐘。
（3） 4℃離心，10000g×15min，離心後，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-lv 仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當於所加的Trizol試劑量的60%。
（4） 仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉澱RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。
（6） 4℃離心，10000g×10min。RNA沉澱為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。
（7） 棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震盪，充分洗滌沉澱，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣乾燥（或真空乾燥）後，沉澱重懸於無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA，-70℃儲存備用。
（8）抽提出的細胞總RNA乾燥後加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。於0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結果應為：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分離組織10mg（純組織）加800ul Trizol試劑。
（10） 擴增產物的鑑定
DEPC處理方法如下：
1. DEPC處理
（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。
（2）Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR儀來控制溫度和時間的，所以RT是在PCR反應管中作的。
4. 操作過程中要戴一次性手套，並經常換手套。
zui 好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭後，加入1-2ml的0.1轕C水，在滅菌就行了；現在有進口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的
如何消除汙染
機器執行完後，取出PCR產物時不能隨便丟棄，應該用塑膠手套或其他打結包好後丟入垃圾桶。
（1）試劑：mixer儘量分裝，不要原瓶多次取用。
（2）加樣：原則是DNAzui後加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那麼採取的方法是算出總體積後加在一個管子裡面，混合均勻之後再分裝到各個管子裡去，這樣可以有效地避免誤差及汙染。
另外，普通實驗室容易汙染，且汙染程度很高，與跑電泳還有質粒製備提取都在同一個房間裡有比較大的關係，zui容易造成高濃度汙染的就是產物的開蓋和質粒的稀釋。
RNA定量
RNA也zui 好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至於用分光光度計比較不同標本之間就更不準了。
RNA的貯藏，zui主要的是溫度，－20不夠，zui 好－80，液氮zui保險
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度的影響
RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但後來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利於PCR的進行
一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關係，計算的是相對錶達程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對錶達量，不是jue 對錶達量
mRNA的分離與純化中
步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然後冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A )尾處的二級結構，使Poly(A )尾充分暴露，從而提高Poly(A )RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的汙染。所以此步驟不能省略。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3）保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,並且用pH7.0的Tris緩衝液補充到10 ul的總體積，然後密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恆溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中儲存1 h。
時間到了之後，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成後，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶汙染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶汙染。
PCR汙染與對策
PCR擴增產物汙染，這是PCR反應中zui主要zui常見的汙染問題，所以，擴增區的儀器什麼如槍頭等要注意。
還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產物汙染的形式是氣溶膠汙染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及汙染進樣槍的反覆吸樣都可形成氣溶膠而汙染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000複製，因而由其造成的汙染是一個值得特別重視的問題。
1. 標本處理區，包括擴增摸板的製備；
2. PCR擴增區，包括反應液的配製和PCR擴增；
3. 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的製備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本製備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的汙染；
操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dNTP、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的度。
反應液汙染
可採用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30 min後加熱滅活，然後加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道汙染DNA的序列；
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由於UV照射的去汙染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用於檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。
1、提取mRNA時所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1轕C水浸泡。然後烘乾，高壓滅菌，再烘乾。
2、用DEPC水洗過後當然不能用雙蒸水洗了。那你用DEPC處理還有什麼意義呢？還要用雙蒸水洗嗎？
3、玻璃器皿幹烤：180度，8小時或更長時間；小器皿也可以用少許lv 仿處理一下。另外，鐵製品、研砵等也可倒上酒精直接燒。