原理:
要進行重組DNA 實驗,就離不開外源基因的純化,而外源基因主要來源之一就要直接從生物的染色體DNA上製備,所以製備高質量的染色體DNA樣品經常為基因工程實驗所需要,抽提細菌染色體DNA的方法目前已有許多種,這裡所介紹的兩種方法:一適用於枯桿菌染色體的抽提;另一種方法則適用於大腸桿菌染色體的製備.
基因工程實驗所需要的基因組DNA 通常要求分子量儘可能大,以此增加外源基因獲得率,但要獲得大片段的DNA 非易事,細菌基因組DNA通常是個很大的環狀態DNA,而在抽提過程中,不可避免的機械剪下力必將切斷DNA,如果要抽提到大的DNA 分子,就要儘可能地溫和操作,減少剪下力,減少切斷DNA 分子的可能性;分子熱運動也會減少所抽提到的DNA分子量,所以提取過程也要儘可能在低溫下進行.另外細胞內及抽提器皿中汙染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA,所以製備過程要抑制其核酸酶的活性.
另外製備的細菌染色體DNA 必須是高純度的,以滿足基因工程中各種酶反應的需要,製備的樣品必須沒有蛋白汙染,沒有RNA,各種離子濃度應符合要求,這些在染色體制備時都應考慮到.
大腸桿菌染色體DNA 抽提首先收集對數生長期的細胞,然後用離子型表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)破裂細胞,SDS 具有的主要功能是:(1)溶解細胞膜上的脂類和蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜;(2)解聚細胞膜上的脂類和蛋白質,有助於消除染色體DNA上的蛋白質;(3)SDS 能與蛋白質結合成為R1—0—SO3R2—蛋白質的複合物,使蛋白質變性而沉澱下來.但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以後的提取過程中,必須把它除乾淨.以免影響下一步RNase的作用.破細胞後RNA經RNase消化除去,蛋白質經苯酚、氯仿:異戊醇抽提除去經灑精沉澱回收DNA.枯草桿菌染色體制備與上類似,但略加修改的方法要適合教學要求.枯草桿菌是格蘭氏陽性菌,所以在SDS 處理前需要使用溶菌酶裂解細胞壁.溶菌酶是一種糖苷水解酶,它能水解菌體細胞壁的主要化學成份肽聚糖中的β—1,4 糖苷鍵,有助於細胞壁破裂,破裂的細胞壁在SDS 的作用下溶菌,同時用蛋白酶K 消化蛋白質,能解離纏繞在染色體DNA上的蛋白質,然後加入一定量的醋酸鉀,使蛋白質變性,通常離心除去,在這期間可加入核糖酸酶消化RNA,最後用乙醇回收DNA.
此二種方法抽提的細菌染色體DNA,無RNA和蛋白質汙染,可用於限制性內切酶消化,分子再克隆等.但在下一步實驗前,要測定其DNA的濃度,常用測定DNA 濃度的方法,是溴化乙錠電泳法;當DNA 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時,加入的EB 會增強發射的熒光.而熒光的強度正比於DNA 的含量,如將已知濃度的標準樣品作電泳對照,就可估計出待樣品的濃度。
原理:
要進行重組DNA 實驗,就離不開外源基因的純化,而外源基因主要來源之一就要直接從生物的染色體DNA上製備,所以製備高質量的染色體DNA樣品經常為基因工程實驗所需要,抽提細菌染色體DNA的方法目前已有許多種,這裡所介紹的兩種方法:一適用於枯桿菌染色體的抽提;另一種方法則適用於大腸桿菌染色體的製備.
基因工程實驗所需要的基因組DNA 通常要求分子量儘可能大,以此增加外源基因獲得率,但要獲得大片段的DNA 非易事,細菌基因組DNA通常是個很大的環狀態DNA,而在抽提過程中,不可避免的機械剪下力必將切斷DNA,如果要抽提到大的DNA 分子,就要儘可能地溫和操作,減少剪下力,減少切斷DNA 分子的可能性;分子熱運動也會減少所抽提到的DNA分子量,所以提取過程也要儘可能在低溫下進行.另外細胞內及抽提器皿中汙染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA,所以製備過程要抑制其核酸酶的活性.
另外製備的細菌染色體DNA 必須是高純度的,以滿足基因工程中各種酶反應的需要,製備的樣品必須沒有蛋白汙染,沒有RNA,各種離子濃度應符合要求,這些在染色體制備時都應考慮到.
大腸桿菌染色體DNA 抽提首先收集對數生長期的細胞,然後用離子型表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)破裂細胞,SDS 具有的主要功能是:(1)溶解細胞膜上的脂類和蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜;(2)解聚細胞膜上的脂類和蛋白質,有助於消除染色體DNA上的蛋白質;(3)SDS 能與蛋白質結合成為R1—0—SO3R2—蛋白質的複合物,使蛋白質變性而沉澱下來.但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以後的提取過程中,必須把它除乾淨.以免影響下一步RNase的作用.破細胞後RNA經RNase消化除去,蛋白質經苯酚、氯仿:異戊醇抽提除去經灑精沉澱回收DNA.枯草桿菌染色體制備與上類似,但略加修改的方法要適合教學要求.枯草桿菌是格蘭氏陽性菌,所以在SDS 處理前需要使用溶菌酶裂解細胞壁.溶菌酶是一種糖苷水解酶,它能水解菌體細胞壁的主要化學成份肽聚糖中的β—1,4 糖苷鍵,有助於細胞壁破裂,破裂的細胞壁在SDS 的作用下溶菌,同時用蛋白酶K 消化蛋白質,能解離纏繞在染色體DNA上的蛋白質,然後加入一定量的醋酸鉀,使蛋白質變性,通常離心除去,在這期間可加入核糖酸酶消化RNA,最後用乙醇回收DNA.
此二種方法抽提的細菌染色體DNA,無RNA和蛋白質汙染,可用於限制性內切酶消化,分子再克隆等.但在下一步實驗前,要測定其DNA的濃度,常用測定DNA 濃度的方法,是溴化乙錠電泳法;當DNA 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時,加入的EB 會增強發射的熒光.而熒光的強度正比於DNA 的含量,如將已知濃度的標準樣品作電泳對照,就可估計出待樣品的濃度。