PCR技術的基本原理

⑴PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴於DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，藉助一小段雙鏈DNA來啟動合成，透過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-OH末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

PCR反應的基本成分包括：模板DNA(待擴增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩衝液。類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的低溫退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈重複迴圈變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留複製鏈”，而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控裝置，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。